肠道菌群在非酒精性脂肪肝炎症反应中的作用

袁梦淑，宋红丽

（1.天津医科大学一中心临床学院，天津 300192；2.天津市第一中心医院肝移植科，天津市器官移植重点实验室，天津市器官移植临床医学研究中心，天津 300192）

非酒精性脂肪性肝病（non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）主要包括两大病理过程：非酒精性肝脂肪变性（nonalcoholic fatty liver，NAFL）和非酒精性脂肪性肝炎（nonalcoholic steatohepatitis，NASH）。NAFL 仅仅指肝细胞内甘油三酯聚集，在肝细胞内形成脂滴，肝细胞脂肪变性，而NASH 以脂肪性肝炎、肝细胞损伤和炎症反应为特点。超过40%的NASH 患者均可发现门脉和肝小叶炎症［1-4］。因此，减轻NAFLD 患者的全身慢性低度炎症反应，有助于延缓NAFLD 的发展。

肠道菌群及其代谢物是模式识别受体（pattern recognition receptors，PRRs）的重要配体。肠道黏膜免疫系统中的Toll 样受体（toll-like receptors，TLRs）和Nod 样受体（nod-like receptors，NLRs）可以识别细菌代谢产物，例如：脂多糖（lipopolysaccharide ，LPS）、鞭毛蛋白和肽聚糖，从而抵御外来病原体入侵，而肝脏中的TLRs、NLRs 及炎症小体促进肝脏炎症反应，在NAFLD 的发展中发挥重要作用。

1 肠道菌群通过免疫细胞引起NAFLD 炎症反应

在NASH 中，初级免疫和由淋巴细胞介导的适应性免疫共同促进肝脏炎症的发生。脂肪变性、肝小叶淋巴细胞浸润和肝细胞气球样变是肝细胞损伤的典型变化［5］。肝小叶淋巴细胞浸润被认为是NAFLD 向肝纤维化、肝硬化和肝细胞癌转变的重要病理变化［6］。大约60%的NASH 患者可见B 细胞和T 细胞的灶状聚集，这些灶聚状集的大小和多少与肝小叶炎症和肝纤维化评分密切相关［7］。大量NASH 动物模型均证实CD4+和CD8+T 细胞、B 细胞、自然杀伤T 细胞（natural killer T cell ， NKT cell）、库普弗细胞在脂肪性肝炎中的浸润，而且浸润程度与肝实质损伤密切相关。

基因敲除ob/ob 肥胖小鼠（肥胖自发突变的纯合子小鼠Lepob，通常写作ob 或ob/ob）通常对LPS介导的肝脏损伤更敏感，与痤疮丙酸杆菌感染的正常小鼠的肝脏损伤相似。小鼠经LPS 处理后血浆中白细胞介素（interleukin，IL）-18 水平增高，肝脏CD4+、NK 细胞数量下降，IL-4 生成减少，使Th-1和Th-2 细胞之间的平衡被破坏，导致Th-1 细胞来源的促炎细胞因子相对增多，Th-2 来源的抗炎细胞因子相对减少［8-9］。

B 细胞通常出现在富集T 细胞的淋巴细胞浸润灶，并与脂肪性肝炎的发生密切相关。在小鼠NAFLD 模型中，浸润B 淋巴细胞主要有2 种：B1 淋巴细胞可在多种抗原刺激下激活产生IgM 型抗体。B2 亚群需要T 辅助细胞增殖，分化为浆细胞产生高度抗原特异性的IgA、IgG、IgE［10］。

库普弗细胞定位于肝血窦中，与来自肠道的血液密切接触，比外周血更容易暴露在肠道来源的内毒素、饱和脂肪酸、胆固醇及其代谢物以及与肝细胞损伤相关的分子中。不同于脂肪组织，肝脏拥有基数较大的巨噬细胞，大约占肝脏所有细胞的5%。库普弗细胞的数量不随脂肪的增加而增加，但它们的活化状态与脂肪成正比［11-12］。临床研究发现，M1型库普弗细胞活化与肝细胞脂肪性变和凋亡、募集免疫细胞、肝纤维化有关，而M2 型库普弗细胞则能减轻炎症反应和肝脏损伤，M1/M2 型库普弗细胞的比例在NAFLD 的慢性炎症中发挥着重要作用［13］。体内和体外试验均证实，当肝脏暴露于LPS 时，库普弗细胞通过产生肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）和IL-1 来消灭LPS 的细胞毒作用［14-16］。NAFLD中的库普弗细胞活化不仅限于肝脏，它们在脂肪组织中的存在有助于在肥胖中观察到的低度炎症，并且还与NAFLD 组织学有关［17］。

2 肠道菌群通过模式识别受体引起NAFLD 炎症反应

无论是病原微生物还是共生微生物，它们与宿主的互作主要通过宿主天然免疫细胞表达的PRRs 实现。这些PRRs 识别病原体相关分子模式（pathogen-associated molecular patterns， PAMPs，现在也叫做代谢相关分子模式，microbe-associated molecular patterns， MAMPs）和宿主来源的损伤相关分子模式（damage-associated molecular patterns，DAMPs）。目前已经发现的模式识别受体有6 种［18-19］，包括：① TLRs，这是一类跨膜分子，主要定位于细胞膜或内涵体膜，胞外区识别配体，胞内区负责传递信号，引起炎症因子表达和Ⅰ型干扰素生成。② C 型凝集素样受体（C-type lectin-like receptors， CLRs），也是一种跨膜分子，主要包括Dectin-1、Dectin-2、Dectin-3，识别来源于真菌的糖类分子。③ NLRs，这是一类细胞内感应分子，可以识别多种PAMPs 和DAMPs。④ 维甲酸诱导基因样受体（retinoic acid inducible gene Ⅰ - like receptors，RLRs）是一种胞内受体，主要识别病毒来源的核酸，启动抗病毒免疫信号。⑤ AIM2 样受体（absent in melanoma 2-like receptors， ALRs）主要在胞浆中识别DNA，启动天然免疫信号。⑥ 环鸟苷酸-腺苷酸合成酶（cyclic GMP-AMP synthase， cGAS）主要识别细胞中异常存在的双链DNA［20］，其介导干扰素基因刺激因子（stimulator of interferon genes， STING）的激活，即cGAS-STING 感受通路，诱导Ⅰ型干扰素产生，抵御病原微生物感染。

部分NLRs 和ALRs 可以招募其他蛋白，如ASC和pro-Caspase-1，形成炎症小体，活化Caspase-1进行切割pro-IL-1β 和/ 或pro-IL-18， 使之成熟和分泌，或者切割gasdermin， 引起细胞焦亡（pyroptosis）， 在抗感染和维持机体免疫稳态中非常重要［21］。与肠道菌群所致炎症反应有关的PRRs 主要是TLRs 和NLRs，以及部分NLRs 组装成的炎症小体。

2.1 TLRs 家族：在哺乳动物中，已被确认的Toll样受体有13 种（人类为TLR1-TLR10；小鼠为TLR1-TLR13，没有TLR10），可被分为2 大类：表达于细胞膜表面（TLR1、TLR2、TLR4、TLR5、TLR6、TLR11）和表达于细胞内吞体膜（如核内体、溶酶体、内质网）表面（TLR3、TLR7、TLR8、TLR9）［22］。细菌成份（LPS、蛋白、聚糖和核酸等）可激活TLRs，刺激免疫细胞产生炎症因子和共刺激分子［22-23］。其中TLR2、TLR4、TLR5、TLR9 与NAFLD 的发生发展密切相关［24］。

TLR2 通常与TLR1、TLR6 或一些非TLR 分子（如Dectin-1）形成异二聚体，通过MyD88 依赖途径与NOL1 和NOL2 共同识别肽聚糖（peptidoglycan，PGN）、脂磷壁酸（lipoteichoic acid，LTA）、脂阿拉伯甘露聚糖（lipoarabinomannan，LAM）、脂蛋白及脂肽等多种菌体成份［22］。 TLR2 敲除（TLR2-/-）小鼠可以改善由高脂饮食（high fat diet， HFD）引起的代谢综合征［25-26］。在胆碱缺乏的氨基酸饲料（choline-deficient amino acid-defined， CADD） 喂养的小鼠中，TLR2 可以激活巨噬细胞中的炎症小体促进NASH 的发展［27］。然而，也有研究表明，在蛋氨酸和胆碱缺乏饮食（methionine and choline diet，MCDD）引起的脂肪性肝炎中，TLR2-/-小鼠过氧化物酶体增殖物激活受体γ （peroxisome proliferatorsactivated receptor γ， PPAR-γ） 表达量降低，炎症因子和肝纤维化指标升高［28-29］。这可能是由于不同饮食导致的代谢综合征表现以及肠道菌群的改变不同，造成TLR2 的作用产生相反的结果。

TLR4 的作用主要是识别LPS。LPS 是革兰阴性细菌死亡后细胞壁分解的产物，通过脂蛋白运载进入肠道毛细血管，最终汇入门静脉，肝脏是LPS 的首个靶器官。LPS 激活TLR4 通路引发的慢性低度炎症是NAFLD 发展的重要因素［10］。LPS 和LPS 结合蛋白（LPS-binding protein， LBP）形成LPS-LBP复合物，在CD14 的引导下，与免疫细胞、血小板及肝细胞表面的TLR4-髓样分化蛋白2 （Myeloid differentiation protein-2， MD2）复合物结合，可引起两条通路改变［23］：① TIRAP-MyD88 通路：通过衔接蛋白-髓样分化因子88（Myeloid Differentiation Protein-88，MyD88）激活IL-1 受体相关激酶（IL-1 Receptor Associating Kinase， IRAK）。此外，它还会通过位于IRAK 下游的衔接蛋白TRAF-6（TNF Receptor-associated Factor-6， TRAF-6）刺激与炎症反应有关的核因子κB （nuclear factor kappa-B， NFκB）和丝裂原活化蛋白激酶家族（mitogen-activated protein kinases， MAPKs）等的活化作用，展现其转录活性，引发炎症反应。② Toll 样受体相关分子（toll receptor associated molecule， TRAM）-Toll 样受体相关的干扰素活化分子 （TIR domain-containing adaptor inducing IFN-β， TRIF）通路：TLR4 进入细胞质后，便通过TRAM-TRIF 激活TRAF3 和TRAF6。TRAF3刺激干扰素调节因子3 （interferon regulatory factor 3，IRF3）引发Ⅰ型干扰素反应，TRAF6 刺激NF-κB引起炎症反应。不同细菌产生的不同LPS 结构可选择性激活这些通路。例如，类脂A 在LPS 的生理活性表现起着最重要的作用，其可不依赖CD14 激活MyD88 通路。

TLR5 可识别细菌鞭毛蛋白。小肠固有层内的CD11c+CD11b+树突状细胞膜表面TLR5 被激活后可产生视黄酸调节细胞和体液免疫，促进Th17、Th1分化，加速初级B 细胞的分化为浆细胞，产生IgA，增强肠道免疫功能。TLR5-/-小鼠肠道菌群发生改变，引起低度炎症信号通路激活，这种炎症反应交叉致敏胰岛素受体通路，引起代谢综合征［14］。另外，肝细胞表面的TLR5 可缓解由高脂饮食引起的肝脏脂肪变性，加速清除易位在肝脏中的肠道菌肠［30］。在NAFLD 患者中，肠道菌群易位激活TLR5 引起的炎症反应，可增加患者肝癌的发病率［31］。

TLR9 存在于树突状细胞、B 细胞和巨噬细胞内体、溶酶体或内质网中，识别细菌DNA 中的未甲基化胞嘧啶-磷酸-鸟嘌呤（CpG 岛）［8］，通过MyD88 依赖途径引起炎症反应和Ⅰ型干扰素反应，刺激细胞产生γ-干扰素（interferon -γ，IFN-γ）、TNF-α、IL-6 等炎症因子［15］。未甲基化的CpG 寡核苷酸存在于细菌和病毒中，而哺乳动物基因组中含有少量的甲基化的CpG 寡核苷酸，只有线粒体DNA 含有大量未甲基化的CpG 寡核苷酸［32］。NAFLD 患者肝脏中至多有2.5×104个细菌DNA 片段［33］。移位细菌或细菌DNA 被细胞摄取后，便可激活细胞内的TLR9，引起炎症反应。另外，NASH患者血浆中含有高浓度肝细胞来源的线粒体DNA（mitochondrial DNA， mtDNA），这些mtDNA 也可以通过TLR9 激活先天免疫系统，产生IL-1β，促进NASH、肝纤维化和胰岛素抵抗的发展［34］。

2.2 NLRs 家族：NLRs 是胞内模式识别受体的主要成分，其中，NOD1 和NOD2 识别胞内细菌成分；由NLRs 形成的NALP3 炎性小体对多种刺激产生反应，刺激免疫细胞产生IL-1［23］。TLRs、NLRs 最终激活NF-κB 和MAPKs 信号通路，从而调节免疫和炎症基因表达。

NLRs 家族识别细胞质中的PAMPs 和DAMPs。根据N 端结构，NLR 分为5 个亚群：NLRA、NLRB、NLRC、NLRP、NLRX。迄今为止，至少发现了23 种人类NLR 基因，但是大部分NLRs 的生理功能仍然不清楚。NOD1 和NOD2 属于NLRC 亚群，可识别所有革兰阴性细菌和部分革兰阳性细菌表面的PGN中的不同结构模体，引发炎症反应。PGN 如何被转运到细胞质并与NOD1 和NOD2 结合现在仍不清除［23，35］。

2.3 炎性小体：炎性小体是由部分NLRs 组装的胞浆内PRRs，通过自身催化作用激活caspase-1，引起细胞焦亡、炎症和纤维化。目前已发现5 种炎性小体：NLRP1、NLRP3、NLRC4、IPAF 和AIM2。NLRP3 炎性小体在肝脏中表达最高，可识别LPS、PGN、LTA、双链DNA 等多种菌体成分［23］，释放IL-1 家族炎症因子［35-36］。

3 总 结

在NAFLD 发展过程中，肠道菌群失衡、肠黏膜渗透性改变均增加肠源性病原体汇入门静脉的概率，使肝脏在肠道菌群导致的炎症反应中充当重要的靶器官，由此引发的炎症反应进一步加重了肝细胞损伤和全身炎症反应引起的代谢障碍。故维持肠道菌群平衡，增加优势菌和致病菌比例可减轻肝脏炎症反应，延缓NAFLD的发展。在NAFLD的治疗中，不能忽视维持肠道菌群平衡，从而减轻机体炎症反应及疾病的进展。