放射性损伤导致的唾液腺内源性休眠干细胞的研究进展

肖向阳 张霓霓 综述 黄桂林△ 审校

(1.遵义医科大学，贵州 遵义 563000；2.遵义医科大学附属口腔医院颌面外科，贵州 遵义 563000)

唾液腺是人或脊椎动物口腔内分泌唾液的腺体，其对放射线敏感，因而在头颈部恶性肿瘤放疗中易受到损伤，致机能减退，出现口干、口内黏膜炎、溃疡等症状[1]。临床防治唾液腺放射性损伤的方法主要是应用细胞保护剂、促涎剂等修复，但是疗效都不甚理想[2]。近年来，随着唾液腺组织工程学技术发展及干细胞在再生医学领域研究深入，内源性干细胞的移植为唾液腺放射性损伤治疗提供新的可能。与目前已经知晓的其他成体干细胞一样，唾液腺干细胞(SGSC)是一种未分化细胞，存在于已分化唾液腺细胞中，处于休眠状态，有着自我更新和分化成特定细胞能力[3]。现阶段，国内外诸多研究发现动物以及人的唾液腺中存在具体成体干细胞特征的细胞，且有研究应用药物促进SGSC的增殖，对唾液腺放射性损伤起到了修复作用，并对作用机制进行了深入探究[4]。本文基于国内外关于放射性唾液腺损伤的发生机制及治疗的相关研究进行综述。

1 唾液腺放射性损伤的病理生理

唾液腺是人体重要的组织，由薄壁组织和间质组成。其中，实质为腺上皮细胞形成的腺泡和导管；间质是由纤维结缔组织和小叶间或小叶间隔形成的包膜，其中有血管、淋巴管和神经。腺泡是产生唾液的重要组织，分为浆液型、黏液型和混合型。摘要人的唾液腺由腮腺、颌下腺、舌下腺等许多大腺体和许多小腺体组成。它们都有通向口腔的分泌唾液的导管。唾液中所含的水和黏液可以起到更好的作用。润滑口腔。据调查，成人每天唾液分泌量为1～1.5 L，不同腺体分泌量不同，其中腮腺、颌下腺和舌下腺分泌的唾液腺超过90%。一般来说，60%～65%的唾液由颌下腺锁分泌，20%～30%由腮腺分泌，剩下的2%～5%由舌下腺分泌。唾液腺细胞高度分化，有丝分裂期较长。腺泡细胞通常是有丝分裂后的细胞，应该是辐射不敏感的组织。然而，唾液分泌在辐射后不久就会显著减少，临床上对辐射高度敏感的性别尚不清楚[5]。通常在放射线照射后数小时内逐渐发生压痛，偶尔也会发生明显的肿胀。持续照射3d后唾液量明显减少，后期腺体会萎缩，唾液分泌偶尔会恢复，但与放疗前相比，分泌量明显减少，口干症状明显。放射治疗引起的唾液腺损伤的病理表现主要为炎性细胞浸润、胶原纤维增加、细胞萎缩、腺泡细胞内线粒体空泡变性[6]。

2 SGSC的发现及与放射性唾液腺损伤相关性

在正常情况下，成熟的个体组织中只有很少的干细胞。但是当组织受损时，干细胞就会增殖和分化，以修复受损组织。M.Kwak等[7]提出了双储备干细胞理论，即唾液腺排泄管(ED)中的基底细胞和间充质细胞(ID)可能具有长生不老增殖和定向分化的潜能，可分化为唾液腺组织干细胞。何荣根等[8]的研究表明，所有具有增殖和分裂活性的腺细胞都可能成为干细胞，参与腺体的自我更新和受损腺体的修复。

临床研究[9]显示，干细胞在辐照后仍存在干细胞，并能繁殖和分化，进而促进唾液腺的结构和生理功能良好恢复。Y.atsuishi等[10]实验研究发现，在放疗后颌下腺组织损伤较小的情况下，仍可在临床样本中发现SGSC，并且很难从接受较高辐射剂量和细胞老化严重的颌下腺组织中培养SGSC。大量研究通过建立动物腺体损伤模型，在动物腺体中发现了具有成体干细胞特征的细胞。K.Okumura等[11]报道大鼠涎腺主导管结扎后，腺泡细胞大部分消失，且会有明显的管细胞增生。当主导管再次松动后，唾液腺又恢复了分泌功能，说明唾液腺组织中有干细胞可以不断分化为腺泡细胞。I.M.Lombaert等[12]首次报道小鼠SGSC在体外诱导向腺泡细胞分化，并可分泌淀粉酶。体内腺移植可恢复部分唾液腺的形态和功能。

有研究者猜测辐射唾腺损伤的主要原因是较高的辐射剂量导致部分SGSC死亡，进而刺激相关信号通路，导致腺泡和导管细胞凋亡，进而对唾腺造成不可逆的损伤。许多学者发现，对大鼠唾液腺进行一次15 Gy X射线照射后第1天，唾液分泌量明显降低。腺泡是唾液产生的主要部分。放射治疗后的急性唾液腺损伤可能与腺泡功能障碍或腺泡细胞死亡有关。A.Vissink等[13]报道，辐照的腮腺腺体老鼠每次15 Gy，发现辐照0～3 d后，唾液分泌减少，和G腮腺腺泡的细胞膜上的蛋白质受体减少和退化，所以他们认为这可能是辐射它破坏了G蛋白受体，是一个组件的细胞膜，导致唾液腺功能下降。纳格尔等人认为这可能是因为分泌颗粒和过渡金属离子位于腺泡的细胞都被激活，共同的信号转导通路，但当氧化还原活性金属离子不是位于颗粒但是很接近的DNA，生殖细胞死亡。因此，可能会发生金属离子介导的增强辐射损伤细胞，但这一机制可能不是辐射诱导的唾液腺损伤的主要原因。

3 SGSC的分布及分类

3.1SGSC的分布 有临床研究[14]报道，SGSC可能位于唾液腺导管和ED中。M.Kwak等[15]首次证实了SGSC参与维持唾液腺稳态，并发现唾液腺导管中存在少量的K14+-sma-细胞。通过遗传谱系追踪，他们发现这些细胞继续自我复制，并在唾液腺发育过程中参与导管的形成和更新。A.W.Konings等[16]研究了鼠腮腺组织对辐射的敏感性，发现有地区差异在辐射后腮腺损伤的程度，和腮腺头组织比尾巴更严重的组织辐射后，表明老鼠腮腺组织负责人包含更多的干细胞。P.L.Van等[17]发现唾液腺对辐射最敏感的排泄管可能是SGSC的来源。以上研究表明，SGSC在唾液腺中的分布不均匀，主要集中在唾液腺较大的ED部位。建议放疗时应保护唾液腺较大的ED，即可以更好地保护SGSC，放疗后可能修复受损的唾液腺组织和功能。

3.2SGSC的分类 下颌下腺干细胞：国外研究人员将动物颌下腺主管结扎，分离培养上皮样细胞，标记表达α6β1整合素和层粘连蛋白(LN)的上皮样细胞，命名为SGP-1细胞。细胞功能组织干细胞可分化为内胚层细胞系。T.Kishi等[18]首次证明了新生和成熟小鼠颌下腺管细胞中均存在自我更新的多功能唾液腺干细胞/祖细胞，并发现成年小鼠颌下腺干细胞的增殖潜能弱于新生小鼠。他们成功地制备并使用单细胞培养系统进行克隆繁殖。Y.G.Man等[19]利用悬浮球培养系统成功分离培养出小鼠颌下腺源性干细胞，证实干细胞来源于导管上皮；体外实验[20]表明，该细胞在体内具有向唾液腺导管细胞和腺泡细胞分化的能力，实验证明，移植的干细胞恢复了部分分泌功能。国外研究发现，从未结扎下颌下管的正常大鼠腺体中分离培养的SGCG高表达α6β1和c-Kit，并可在12个月内分化通过92次传代维持细胞形态、增殖和多向性。此外，这些SGCGs可分化为内胚层细胞系，形成腺泡样细胞和分泌胰岛素的细胞。此项研究证实，正常大鼠腺体中也存在SGCG，这些细胞可作为种子细胞治疗唾液腺损伤或糖尿病。腮腺干细胞：最近几年，关于腮腺干细胞相关研究不多。Rotter等人首次自人腮腺中分离并鉴定出人腮腺干细胞[21]。O.Katsumata等[22]的研究结果表明，注射后大鼠腮腺腺泡细胞和横纹肌细胞增生，但不包括间充质细胞。注射后第5天，腺泡细胞总数增加了60%，细胞与小叶之间的横纹肌细胞数量无明显变化。因而，认为增殖纹状体细胞可能分化成腺泡细胞。小唾液腺干细胞(MSGs)：作为一种与主要唾液腺同源的组织，理论上也应该含有SGCG。MSGs具有来源广、取材便捷、创伤小、供体隐蔽等优点。然而，目前国内外关于MSGs和SGCG的研究报道并不多。从肌聚糖中分离培养SGCG可为干细胞治疗和组织工程提供新的种子细胞来源。陈玉成等[23]首次得到干燥综合征患者下唇微信号。在光镜下，MSGs结构正常。体外分离、培养公司获得的细胞群混合成纤维细胞和epithelial-like细胞向脂肪细胞分化的潜能，软骨细胞和神经细胞的修复，和早期的干细胞标记物的表达，包括NANOG Oct-3/4 SSEA-3除此之外，它还表达间充质干细胞标记CD90-thy1特点。与此同时，实验研究发现，在细胞群中有部分细胞表达角蛋白7/8，由此提示具有上皮细胞表型；但是不表达水通道蛋白1，说明细胞群以间充质干细胞占主导，上皮干细胞要少。唾液腺间充质干细胞(MSCs)：MSCs是拥有数种潜能的一类成体干细胞，已成人多种体间充质组织内分离出来。该细胞能够在体外培养，增殖和分化为各类结缔组织、骨骼及神经等细胞。无论是自体骨髓间充质干细胞还是异体骨髓间充质干细胞，它们通常不会引起宿主免疫应答。所以，骨髓间充质干细胞可以作为组织工程的种子细胞用于干细胞移植治疗。组织特异性培养基可诱导干细胞向中胚层、外胚层和内胚层分化。此外，在肝脏部分切除之后，体外培养的hMSGMSCss被移植到严重联合免疫缺陷(SCID)小鼠体内。hMSGMSCs存活并迁移，表达干细胞标记物AFP和KPT18。上述相关研究均证实hMSGMSCss的存在及其在干细胞治疗和再生医学方面的潜力。

4 SGSC治疗唾液腺放射性损伤研究

在临床放疗中最大限度保护SGSC是预防和治疗唾液腺放射损伤的有效措施。然而，因当前的临床放疗技术水平及有关研究成果不完善，其防治效果收到很大影响。此外，对于晚期头颈部恶性肿瘤患者，因瘤体较大，该类患者的SGSC大多已受到不可逆的损伤，被激活可能性相对要小，因而，SGSC的修复效果不甚理想。SGSC组织学研究为唾液腺放射损伤防治提供了新思路。近年来，国内外许多研究探讨了SGSC在治疗唾液腺放射损伤中的作用。动物实验显示，从小鼠颌下腺提取C-Kit+干细胞，注入放射损伤模型大鼠颌下腺。90 d后，观察到注射部位出现了腔体结构，腺体被移植。镜下外观与正常腺体一致，可见大量腺泡细胞。有研究[24]显示，SGSC干细胞移植后，腺体将恢复23%～70%的分泌功能。该项研究首次证明了利用SGSC移植技术修复放射性唾液腺损伤的可行性。I.Lombard等[25]将表达C-Kit、CD133、CD49f、CD24的干细胞标记细胞注入辐射损伤后的大鼠颌下腺，发现大鼠的唾液量明显增加。其中C-Kit+和CD133+细胞注射量较大。小鼠唾液量明显增加。放射损伤后，将C-Kit+细胞及CD24和(或)CD49联合标记阳性干细胞注入大鼠颌下腺，验证干细胞移植对损伤腺的修复作用。T.Nagamura等[26]从正常大鼠唾液腺中分离获得侧群(SP)细胞，未经培养就移植到辐射损伤大鼠唾液腺中。受损唾液腺功能在2个月内恢复正常，但恢复后唾液腺均在显微镜下观察。在移植部位未见腺泡及导管样结构。本研究证实了体外培养SGSC以及应用标记蛋白改善和加强放射损伤后唾液腺的恢复的重要性。D.Andreadis等[27]利用人颌下腺培养人颌下腺干细胞(hSGSCS)，将其移植到辐射损伤大鼠的唾液腺中，研究发现，干细胞可分化为腺泡和导管结构，有效修复受损的唾液腺功能，恢复唾液腺形态。I.Lombaert等[25]利用人腮腺内分泌管上皮细胞和间充质干细胞表面标记物(Lgr+CD90+)培养SGSC，其多能性在大鼠唾液腺辐射损伤模型实验中得到证实。K.Mishim等[28]为研究SGSC功能及与供体的年龄相关性，分别从幼年(8～12周)与老年大鼠(22～26个月)中分离培养，同时通过流式细胞仪得到CD24+、CD29+、SGSC，并通过体外培养发现，虽然年龄较大大鼠模型原代干细胞形成细胞集落能力要低于幼年大鼠，但两组经细胞传代后扩增能力无明显差异。由此看出，人SGSC的作用可能与供体的年龄不无相关性，此项研究为老年人自体SGSC的治疗应用提供可能。

C.Y.Lin等[29]研究报道，对骨髓间充质干细胞(BMSCs)进行纳米粒子标记后，其直接与腺泡的细胞一起培养，对于标记腺泡样细胞在分化后获得，获得两个标记细胞移植到小鼠的唾液腺分离与重度联合免疫缺陷症X射线辐照下，结果表明，干细胞疗法可减小辐照的唾液腺损伤，进而恢复小鼠唾液分泌和腺体的量，腺泡样细胞有更好治疗潜力。D.Andreads等[30]通过免疫组化分析小鼠颌下腺组织，发现表达干细胞标记物的唾液腺细胞通常位于唾液腺较大的导管中。将这些细胞移植到辐射损伤的颌下腺后，发现小鼠唾液腺细胞中表达了不同的干细胞相关标志物。干细胞标志物可特异性恢复唾液腺分泌功能。被辐射损伤唾液腺可通过干细胞移植再生。唾液的数量会显著增加，这说明这些细胞可以改善被辐射损伤的唾液腺的分泌功能。S.Pringle等[31]研究了脂肪源性基质细胞(ADSCs)在唾液腺辐射损伤上的再生和修复，研究结果显示，相比对照组，研究组小鼠的唾液流量显著改善。两组均有腺泡细胞损伤，但实验组血管增生，腺泡细胞增多，纤维化程度降低。免疫荧光观察脂肪间充质干细胞向血管内皮细胞和导管细胞的分化。基于此推测，ADSCs参与了唾液腺生理功能的恢复过程。

5 结 语

当前，虽有诸多研究探讨了唾液腺放射性损伤发生机制，但确切体机制仍不完全清楚，在很大程度上增加了唾液腺辐射损伤防治困难，但防治损伤仍需摆在重要的位置上。已有多种来源的干细胞应用导致再生医学中。研究报道，SGSC移植是治疗放射性唾液腺损伤的一种有效方法，但当前处于动物模型实验阶段，尚未开展临床实践研究，因而后续要加大此方面的研究力度，以便尽早应用到临床，提高临床防治效果。