红烧卤牛肉货架期预测模型的建立

李 彦 符慧靖 邵乐乐 路玉倩 梁丽雅 吴子健 马俪珍，*

（1天津农学院食品科学与生物工程学院，天津 300384；2中国农业大学食品科学与营养工程学院，北京 100083；3天津商业大学生物技术与食品科学学院，天津 300134）

红烧卤牛肉是我国传统菜品，为达到常温销售的目的，常常对真空包装的牛肉酱卤制品进行高温高压杀菌，然而经高温杀菌后的肉制品会出现令人不愉悦的“蒸煮味”，影响产品的口感。肉制品采用低温杀菌方式（杀菌温度低于100 ℃）可以保持较好的感官品质，但难以将微生物全部杀灭，产品中残存的微生物会在一定的贮藏条件下生长繁殖，从而导致产品腐败变质，不仅会降低产品的品质，而且也会影响人体健康［1］。研究表明，温度是影响微生物生长繁殖最重要的环境因素，10～52 ℃是微生物生长繁殖较快的温度范围［2］，因此欧洲国家对低温肉制品生产过程中的冷却时间有严格的规定，必须在2.5 h 内将产品的中心温度从75 ℃降到10 ℃以下［3］。在产品的贮运和销售过程中，可通过控制低温肉制品的贮藏温度达到延长产品货架期的目的。因此，研究红烧卤牛肉在不同温度下贮藏过程中的微生物数量变化，预测其货架期，对指导低温肉制品的生产具有重要意义。

在肉制品品质评价的指标中，pH 值、硫代巴比妥酸值、挥发性盐基氮等都可以反映肉制品的品质优劣，而这些指标的变化归根结底是由于微生物的变化引起的［4］，因此，利用微生物变化构建产品货架期的预测模型更为直接。食品预测微生物学是基于微生物学、数学、统计学并结合计算机技术建立数学模型，预测一定环境下食品中微生物的消长情况，从而判定食品的货架期［5］。Whiting 和Buchanan 按预测模型的变量类别将预测模型分为三类［6］，一级模型是用于描述食品中微生物生长的数量和时间关系而建立的函数模型，能够计算出食品菌落的最大生长速率、最大生长密度等；二级模型是将一级模型的参数和环境因素（如温度、水分活度等）建立函数关系；三级模型是将一、二级模型结合起来，预测不同环境下食品的货架期［7］。在肉制品研究中，大多学者都以产品的微生物数量变化为参数建立货架期预测模型。刘浩越等［8］将酱卤鸭肉进行气调包装，根据乳酸菌在不同温度（4、10、15、20、25 ℃）条件下的繁殖数目，采用修正的Gompertz 方程和平方根方程建立了一、二级模型，并验证了模型的可靠性。Dalgaard［9］利用Gompertz 模型与Baranyi 模型建立了包装鳕鱼的一级预测模型。赵丽艳等［4］以肉糕为研究对象，测定了不同温度（4、10、15、20、25 ℃）下菌落总数的变化，并利用修正的Gompertz 方程和平方根方程建立了肉糕的货架期预测模型。

本试验以经过二次水煮杀菌的真空包装红烧卤牛肉为研究对象，分别测定其在4、10、15、20、25 ℃恒温培养下菌落总数随贮藏时间的变化情况，利用修正的Gompertz模型进行一级模型的拟合，再利用Belehradek进行二级模型的拟合，并利用统计学对拟合的效果进行评价，再结合一、二级模型建立红烧卤牛肉的货架期预测模型，旨在为红烧卤牛肉在不同温度下的贮藏时间选择提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

牛肋腹部肉、食盐、白糖、味精、八角、花椒、丁香、小茴香、草果、桂皮、豆蔻、葱、豆瓣酱、白酒，天津市王顶堤商贸城世纪华联超市；葡萄糖、复合磷酸盐、抗坏血酸钠，郑州凯之裕食品添加剂有限公司；大豆蛋白粉、亚硝酸钠，郑州裕和食品添加剂有限公司；花椒精油、八角精油、麻椒精油、丁香精油、迷迭香精油，天津市春合科技开发有限公司；氯化钠，天津市风船化学试剂科技有限公司；营养琼脂，青岛高科技工业园海博生物科技有限公司；配制试剂所用水为超纯水。

1.2 仪器与设备

SX-500 多功能高压蒸汽灭菌锅，日本Tomy 公司；CLIMACELL 恒温恒湿箱，德国艾力特国际贸易有限公司；拍打式JZ-4 无菌均质机，天津歆毅翎科技有限公司；CLASSⅡ生物安全柜，天美（中国）科学仪器有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 样品制备 红烧卤牛肉的制作方法参考前期试验［10］：将原料牛肉（脂肪含量为30%）切分成70～80 g的斜方块，经过腌制（腌制液的添加量为20%，腌制液配方见表1，再分别添加花椒精油441.0 µL·kg-1、八角精油337.0 µL·kg-1、麻椒精油17.0 µL·kg-1、丁香精油14.0 µL·kg-1、迷迭香精油137.0 µL·kg-1）并进行真空滚揉（转速设置为5～6 r·min-1，滚揉时间1 h）后，将原料肉表面用保鲜膜包裹好放入4 ℃的冷库中腌制12 h，取出后放入煮锅中煮制（大火煮制30 min 后改小火焖制1 h），煮制完成后捞出牛肉块，冷却后采用耐高温的蒸煮袋进行真空包装，再进行沸水浴杀菌30 min，一次杀菌结束后在常温下放置48 h后进行第二次沸水浴杀菌30 min。

表1 腌制液配方（以100 kg牛肉计）Table 1 Formula of pickling solution （based on 100 kg beef）/g

1.3.2 试验设计 将加工好的产品分成5 组，分别置于4、10、15、20、25 ℃的恒温培养箱中培养，在设定的取样点测定产品的菌落总数，取样点的设定见表2。同时测定二次杀菌处理前样品的菌落总数。

表2 不同贮藏温度的取样点Table 2 Sampling points at different storage temperatures

1.3.3 菌落总数测定 按《GB 4789.2-2016 食品安全国家标准 食品微生物学检验 菌落总数测定》［11］的方法进行检测，每个取样点取3 袋样品进行测定，结果取平均值。

1.4 货架期模型的构建

1.4.1 一级模型 在本研究中，以菌落总数为测定指标，群落结构复杂，微生物生长不具有特定生物学意义［12］，因此，机理模型（Baranyi）在本研究中不适用。Gompertz函数能够有效地描述食品中微生物的生长与时间的对应关系，其预测较为准确，因此选择已经建立的修正的Gompertz模型来描述食品贮藏时间与微生物生长情况。

修正的Gompertz模型函数表达式为［13］：

式中，Nt：t 时刻的菌落总数，lg（CFU·g-1）；N0：初始菌落数，lg（CFU·g-1）；Nmax：体系中最大的菌落生长数，lg（CFU·g-1）；μmax：微生物的最大比生长速率，lg（CFU·g-1）·d-1；λ：迟滞时间，d；t：贮藏时间，d。

1.4.2 二级模型 选用Belehradek 模型［14］（平方根模型）来描述一级模型的各个参数与环境因素（主要是温度）之间的函数关系。

Belehradek模型的表达式为：

式中，T：环境中的温度，℃；μmax：微生物的最大比生长速率，lg（CFU·g-1）·d-1；Tmin：微生物不进行代谢繁殖活动的温度，℃；λ：迟滞时间，d；bλ：方程常数，迟滞时间；bμ：方程常数，最大比生长率。

1.5 模型验证

采用回归相关系数R2与均方误差平方根（root mean square error，RMSE）检验模型拟合的优越程度［15］，并通过统计学参数准确因子（Af）与偏差因子（Bf）对所建立的模型进行验证［16］。当R2越接近1 时，表示模型的拟合效果越好，且认为R2值大于0.8 表示模型拟合度可以被接受［17］，RMSE 值越小，表示模型的拟合程度越好；Af反应了预测值和实测值间的相近程度，Af值在1.1～1.9 之间表示该模型可以被接受，且Af值越低，模型拟合的准确度越高［18］，Bf则表示实测值与预测值之间的偏差值，Bf值在0.75～1.25 之间表示该模型准确度可被接受［19］。各参数表示式如下：

式中，n：数据测量点的数量；Oi：第i个测量点的实测菌落总数，lg（CFU·g-1）；Pi：第i个测量点的预测菌落总数，lg（CFU·g-1）。

式中，U1：实际测量的菌落总数，lg（CFU·g-1）；U0：模型预测的菌落总数，lg（CFU·g-1）。

1.6 货架期预测模型的建立与验证

选出拟合度最好的一级模型，将特定参数代入货架期预测模型中，建立该产品的货架期预测模型，公式如下［20］：

式中，SL：产品货架期，d；N0：初始菌落数，lg（CFU·g-1）；Nmax：微生物生长到稳定期的最大菌落数，lg（CFU·g-1）；Ns：产品的腐败限量值，lg（CFU·g-1）；λ：迟滞时间，d；μmax：微生物的最大比生长速率，lg（CFU·g-1）·d-1。

用货架期实测值与预测值的相对误差值对所建立的货架期模型进行验证，公式如下：

1.7 数据处理

采用SPSS 21.0 软件的ANOVA 分析对数据进行方差分析，用邓肯多重比较进行差异显著性分析；采用Origin 9.0软件进行微生物生长曲线的拟合。

2 结果与分析

2.1 不同贮藏温度下红烧卤牛肉的菌落总数变化情况

二次杀菌处理前样品的菌落总数为2.93 lg（CFU·g-1），经过二次杀菌后，菌落总数降至1 lg（CFU·g-1）以下，说明二次杀菌方式能够有效降低产品的菌落总数，杀菌较彻底，可延长红烧卤牛肉货架期。不同贮藏温度下红烧卤牛肉菌落总数变化情况如图1～5 所示。结果表明，在5 个不同的贮藏温度下，随着贮藏时间的延长，产品的菌落总数生长曲线呈现“S”形，并且存在明显的迟滞期、指数期和稳定期，随着贮藏温度的降低，菌落总数曲线的迟滞期延长，这是因为贮藏温度越低，对微生物生长的抑制作用越强，而产品初始菌落总数＜1 lg（CFU·g-1），说明红烧卤牛肉的杀菌较为彻底。当贮藏温度为4 ℃时，产品的菌落总数生长最为缓慢，迟滞期最长，在贮藏的第260 天后菌落总数开始上升，并在贮藏的第330 天时，菌落总数达到4.37 lg（CFU·g-1），超过了国标限量值4 lg（CFU·g-1）［21］，贮藏温度为10、15、20、25 ℃时，产品微生物菌落总数有明显上升的时间点分别是90、50、26、13 d，菌落总数超过国标限量值的时间分别是180、62、34、16 d，说明低温贮藏能够有效延长红烧卤牛肉的货架期。

图1 25 ℃贮藏温度下红烧卤牛肉菌落总数变化Fig.1 Changes of total bacterial count of braised beef at 25 ℃

图2 20 ℃贮藏温度下红烧卤牛肉菌落总数变化Fig.2 Changes of total bacterial count of braised beef at 20 ℃

图3 15 ℃贮藏温度下红烧卤牛肉菌落总数变化Fig.3 Changes of total bacterial count of braised beef at 15 ℃

图4 10 ℃贮藏温度下红烧卤牛肉菌落总数变化Fig.4 Changes of total bacterial count of braised beef at 10 ℃

图5 4 ℃贮藏温度下红烧卤牛肉菌落总数变化Fig.5 Changes of total bacterial count of braised beef at 4 ℃

2.2 一级模型的拟合与验证

利用Origin 9.0软件构建Gompertz模型，并将不同贮藏温度（25、20、15、10、4 ℃）的微生物生长曲线进行拟合，其中4 ℃微生物生长曲线无法拟合。由表3可知，红烧卤牛肉中微生物的最大生长比率μmax随着贮藏温度的升高而增大，尤其25 ℃时μmax达到0.807 lg（CFU·g-1）·d-1，这是因为常见微生物在此温度下的酶活性较高，使微生物能更好地进行代谢活动［22］，因而微生物生长速率较快。在10～25 ℃的贮藏环境下，微生物的迟滞期λ由11.64 d 上升到78.68 d，说明温度对微生物生长的适应期会产生较大的影响。

根据公式计算得出的一级模型拟合评价参数表见表3。结果表明，4 个温度下微生物菌落总数生长曲线拟合Gompertz模型的R2均大于0.98，且RMSE均较低，表明模型拟合度效果良好，可以被接受；Af与Bf值均接近于1，且值范围分别在1.01～1.09 与0.90～1.05 之间，在可接受范围内，表明利用此模型来预测红烧卤牛肉的菌落总数具有较高的可信度，说明Gompertz 模型可以用来建立红烧卤牛肉的货架期预测模型。根据表3 拟合的参数，得到不同温度Gompertz 模型函数表达式见表4。

表3 Gompertz模型拟合参数及评价参数表Table 3 Fitting parameters and evaluation parameters of Gompertz model

表4 Gompertz模型函数表达式Table 4 Gompertz model function expression

2.3 二级模型的建立与验证

将Gompertz 模型拟合出的不同温度下的参数值μmax与λ分别带入公式（3）、（4）中，利用Origin 9.0 软件进行拟合，拟合效果见图6和图7。由此得到的二级模型的表达式与各评价参数见表5，两个函数的R2均大于0.9，且RMSE均小于0.05，表明模型拟合度效果良好；Af与Bf值均接近于1，范围分别在1.01～1.09 与0.90～1.05之间，在可接受范围内。

图6 迟滞时间与贮藏温度的关系Fig.6 Relationship between hysteresis time and storage temperature

图7 最大比生长速率与贮藏温度的关系Fig.7 Relationship between maximum specific growth rate and storage temperature

2.4 红烧卤牛肉货架期预测模型的建立与验证

将表5 中得到的两个表达式代入公式（8）中，腐败限量值采用国标限量值4 lg（CFU·g-1），最大菌落总数Nmax取不同温度下所得到的平均值6.431 lg（CFU·g-1），可得到红烧卤牛肉的货架期预测模型：

表5 二级模型函数表达式及评价参数表Table 5 Function expression and evaluation parameters of secondary model

红烧卤牛肉在不同贮藏温度下的货架期的预测值与实测值见表6，4 个贮藏温度下货架期模型预测值和实测值的相对误差在10%以内，表明此货架期模型能够有效预测红烧卤牛肉在贮藏温度10～25 ℃时的货架期。

表6 不同贮藏温度下货架期的预测值与实测值Table 6 Predicted and measured shelf life at different storage temperatures

3 讨论

中餐工业化是未来食品行业的发展趋势，而红烧卤牛肉作为一道传统菜品，本研究将其制作成工业化的产品符合市场需求。目前，市面上已存在的酱卤牛肉制品大部分为散装销售，研究表明，在4 ℃冷藏保存的条件下，产品的货架期小于7 d［7，23-24］，极短的货架期限制了产品的销售范围，因此延长红烧卤牛肉的货架期很有必要。由于季节与地区的差异，运输、销售过程以及人们购买产品后所贮存的温度会存在差异，本研究设置的温度包含了可能存在的所有范围，分别是4、10、15、20、25 ℃，探究红烧卤牛肉在上述温度贮藏过程中菌落总数的变化情况，结果发现4 ℃条件下前期菌落总数无明显增长，这与曾巧辉等［25］、Fang 等［26］的研究结果一致。国家规定低温肉制品需要在0～4 ℃的条件下运输，以保证产品的安全性［27］，在0～4 ℃环境下，微生物的酶活性被抑制，无法正常代谢，增值适应期大大延长［28］。本研究对红烧卤牛肉进行真空包装，试验表明温度对微生物生长的适应期会产生较大的影响，刘浩越等［8］在研究气调包装的酱卤鸭制品中得出了相同的结论，而赵国娇等［29］研究发现，对散装的卤鸭翅来说，温度对腐败乳酸菌的迟滞期几乎没有影响，可见包装方式会对微生物生长的迟滞期产生一定影响，有待进一步深入研究。

Belehradek 模型二级模型可用于探究温度环境和微生物生长的函数关系，应用较为广泛［30］。本研究计算得出产品在10、15、20、25 ℃下微生物的最大比生长速率分别为0.035、0.112、0.257、0.807 lg（CFU·g-1）·d-1，预测货架期分别为185.76、64.05、31.00、15.93 d。杨欢等［31］应用相同的一、二级模型探究真空包装狮子头的货架期预测模型，并得出产品在4、10、15、20、25 ℃下微生物的最大比生长速率分别为0.07、0.14、0.42、0.87、0.91 lg（CFU·g-1）·d-1，预测货架期分别为4.01、4.96、10.96、45.22、80.79 d。造成本研究微生物生长速率较低和货架期较长的原因，可能是由于本研究采用了两次沸水煮制的杀菌方式，而杨欢等［31］对产品仅进行一次杀菌，且杀菌温度为85 ℃。何靖柳等［32］以真空包装的坛子肉为研究对象，采用85 ℃微波二次杀菌，分别建立了4、10、25、37 ℃下的货架期预测回归方程，得到的产品预测货架期分别为449.93、339.42、257.50、164.54 d，可见二次杀菌方式能够使低温肉制品的货架期大大延长。综上，试验制得的红烧卤牛肉在常温20 ℃下也有31 d 左右的货架期，因此，产品能够做到远距离运输，且无需冷链条件，降低了运输成本。但在较高的温度（25 ℃）下，产品货架期预测为15.93 d 左右，因此建议夏季应进行低温贮藏保存，且消费者在购买产品后应尽快食用。

根据建立的货架期模型函数可以看出，红烧卤牛肉的货架期与产品的初始菌数和贮藏温度相关，因此，在工业化生产过程中，要控制好加工车间的卫生和温度，保证产品的初始菌数在一个较低的水平，同时严格进行二次杀菌操作，最后在运输销售过程中尽可能保持较低的温度环境，以延长产品货架期。

4 结论

本研究利用一级模型（修正的Gompertz模型）与二级模型（Belehradek 模型）对红烧卤牛肉在25、20、15、10 ℃的温度下进行了货架期预测，并建立了货架期预测模型。结果表明，随着贮藏温度的升高，货架期缩短；结合一、二级模型建立红烧卤牛肉货架期预测模型，可用来预测温度范围在10～25 ℃内的红烧卤牛肉货架期，预测得到的10、15、20、25 ℃的货架期分别为185.76、64.05、31.00、15.93 d。