外泌体在股骨头坏死诊治中的应用

董一平，袁强，张宁，张颖

(1.河南中医药大学研究生院，河南 郑州 450046；2.湖南中医药大学研究生院，湖南 长沙 410208；3.河南省洛阳正骨医院/河南省骨科医院，河南 洛阳 471002)

股骨头坏死(osteonecrosis of the femoral head，ONFH)是股骨头静脉瘀滞、动脉血供受损或中断，使骨细胞及骨髓成分部分死亡引起骨组织坏死及随后发生的修复，共同导致股骨头结构改变及塌陷，引起髋关节疼痛及功能障碍的疾病[1]。ONFH发病机制复杂，临床上采用非手术或手术方法治疗ONFH，但治疗效果均不令人满意[2]。外泌体是一种微小的具有双层膜的细胞外囊泡，在细胞间的交流中担任重要角色[3]。研究发现，外泌体在促进骨形成和血管修复等方面发挥重要作用[4]。因此，外泌体逐渐成为ONFH诊治研究中的新热点。本文对外泌体进行了概述，对外泌体在ONFH诊断和治疗中的应用价值进行了综述。

1 外泌体概述

外泌体的直径为30～100 nm，属于细胞外囊泡[5]。外泌体由成骨细胞、破骨细胞、干细胞等多种细胞分泌，参与细胞间的信号传导、抗原呈递等过程[6-7]。外泌体内含有多种生物活性分子，如跨膜蛋白、肌动蛋白、膜联蛋白等多种蛋白，能够参与细胞的组成和运动[8]；还包括miRNA、非编码RNA、mRNA等多种核酸分子，其中miRNA能够激活信号分子及靶细胞，调节靶细胞的基因表达[9-10]。目前，制备外泌体的方法主要有超速离心法、尺寸排阻色谱法、免疫亲和捕获法和微流体技术等，制备外泌体的原料可以是体液或细胞培养基[11-12]。通常根据外泌体的大小、形态和标记蛋白进行外泌体的鉴定：①外泌体直径30～100 nm；②电子显微镜下外泌体为杯形或圆形；③外泌体含有CD9、CD63、CD81和TSG101等标志蛋白[13]。

2 外泌体在ONFH诊断中的应用价值

早期ONFH通常无明显症状，常采用MRI进行诊断，但此类检查价格昂贵，患者负担较重。研究发现，细胞产生的外泌体能够被释放到血液或体液中，而其内容物能够反映细胞的生理或病理情况，进而反映疾病的发生阶段[14-15]。因此，检测血液或体液中外泌体的内容物成分可能成为诊断疾病发生和发展的新方法[16]。目前，已有关于将外泌体作为诊断ONFH生物标志物的可行性研究。Zhu等[17]采用纳米检测法检测85例激素性ONFH患者和115例健康志愿者的血清外泌体含量，结果显示，激素性ONFH患者的血清外泌体含量低于健康志愿者，外泌体血清含量诊断激素性ONFH的受试者操作特征曲线下面积为0.72，表明外泌体血清含量对激素性ONFH的诊断具有中度准确性。Zhang等[18]纳入5例患激素性ONFH的系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus，SLE)患者、5例无激素性ONFH的SLE患者及5例健康志愿者，抽取3组受试者的血液，并分析血清外泌体中miRNA的差异表达，结果显示，患激素性ONFH的SLE患者血清外泌体中hsa-miR-135b-5p的表达显著上调；提示血清外泌体中hsa-miR-135b-5p可作为诊断激素性ONFH的生物标志物。外泌体携带性质稳定的miRNA，作为诊断早期ONFH的生物标志物，具有较好的灵敏度和准确度，且相较于MRI，更加方便、经济。

3 外泌体在ONFH治疗中的应用价值

3.1 成骨细胞来源外泌体成骨细胞能够促进新骨生成、骨量增加，在骨骼生长与重塑的过程中发挥着重要的作用[19]。Ge等[20]对小鼠成熟成骨细胞MC3T3来源外泌体进行了蛋白质组学分析，结果显示，成骨细胞MC3T3来源外泌体中的肝配蛋白B1、转化生长因子β3、骨形态发生蛋白Ⅰ型受体、Smad泛素化调节因子1和低密度脂蛋白受体相关蛋白6等在骨组织修复过程中发挥重要作用。Ge等[21]进一步研究发现，成骨细胞MC3T3来源外泌体中包含Rho GTPases，而Rho GTPases是Ras超家族的Rho亚类的成员，包括RhoA、Rac1和Cdc42，其中RhoA在骨重塑中具有重要作用。Cui等[22]研究发现，成骨细胞MC3T3-E1来源外泌体能够促进骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cell，BMSC)ST2向成骨细胞分化，且成骨细胞MC3T3-E1来源外泌体通过miRNA转移诱导BMSC ST2中miRNA的表达发生改变。成骨细胞来源外泌体所携带特定的蛋白与miRNA可调控成骨微环境中的细胞间通讯，在成骨细胞分化过程中发挥重要作用。目前，针对成骨细胞来源外泌体的研究正在不断深入，其对于ONFH治疗及发病机制的探索都具有重要意义。

3.2 破骨细胞来源外泌体破骨细胞是骨吸收细胞，由骨髓特定的破骨细胞前体活化后产生，具有减少骨量的作用。在ONFH发生过程中，破骨细胞增多，其分泌的酶和酸性物质分解骨基质，导致骨溶解与坏死，最终使股骨头发生塌陷[23-24]。Huynh等[25]研究发现，破骨细胞前体来源外泌体可以促进破骨细胞的分化与成熟，同时成熟破骨细胞来源外泌体中富含核因子κB受体活化因子配体(receptor activator of nuclear factor-κB ligand，RANKL)，可竞争性的与核因子κB受体活化因子结合，进而抑制破骨细胞的形成；提示破骨细胞来源外泌体是破骨细胞旁分泌的重要调节因子。Sun等[26]研究发现，破骨细胞来源外泌体内的EphrinA2蛋白可与成骨细胞所含有的EphrinA2蛋白受体相结合，将破骨细胞来源外泌体中的miRNA运输至成骨细胞，进而降低成骨细胞活性，造成骨量减少。Li等[27]研究发现，破骨细胞来源外泌体中的miR-214-3p在体外可降低成骨细胞活性，而在体内能够抑制小鼠骨形成。Yang等[28]研究发现，在RANKL诱导的RAW 264.7细胞(破骨细胞祖细胞)来源外泌体中，miR-23a-5p过表达；而含miR-23a-5p的破骨细胞来源外泌体可抑制成骨细胞活性，抑制破骨细胞释放外泌体可缓解对成骨细胞的抑制作用；进一步研究发现，miR-23a-5p通过抑制Runt相关转录因子2的表达参与抑制成骨细胞活性。破骨细胞来源外泌体可通过其内含的生物分子促进破骨细胞的形成，抑制成骨细胞形成。因此，通过靶向破骨细胞来源外泌体减弱其对成骨细胞的抑制作用，从而可缓解骨量减少，改善ONFH。

3.3 间充质干细胞来源外泌体间充质干细胞(mesenchymal stem cell，MSC)是一种非造血多能成体干细胞，能进行自我更新和多向分化，可从骨髓、滑膜、脐带血与胎盘等组织中获取[29]。研究表明，MSC来源外泌体可以通过上调骨形成相关基因表达促进MSC的成骨分化[30-31]。由于MSC具有易培养、来源广、抗原性低等优点，目前正被广泛应用于ONFH领域的研究中[32]。

3.3.1BMSC来源外泌体 随着对BMSC研究的不断深入，BMSC广泛应用于多种骨科疾病的治疗，也是治疗ONFH的新的研究方向[33-34]。BMSC是最早、最常见的外泌体来源之一，多项研究表明[35-36]，BMSC来源外泌体可以促进骨形成，减少骨丢失，进而治疗骨组织损伤。Takeuchi等[37]在MSC细胞培养基中分别加入BMSC、BMSC来源外泌体和含有血管生成抑制剂的BMSC来源外泌体后，检测MSC的成骨分化潜能，结果显示BMSC来源外泌体能够显著增强MSC的细胞迁移及成骨分化、血管生成相关基因的表达。Zhang等[38]研究发现，BMSC来源外泌体能够显著增强股骨骨不连模型大鼠的成骨、血管生成和骨愈合过程，进一步研究发现人脐静脉内皮细胞和成骨细胞MC3T3-E1可通过吸收BMSC来源外泌体，改善其增殖和迁移能力。Zhang等[39]研究发现，BMSC来源外泌体可以通过促进血管生成对由类固醇诱导的ONFH细胞模型起修复作用，同时BMSC来源外泌体可以作为siRNA的载体，提高siRNA的转染效率。Fang等[40]研究了BMSC来源外泌体对类固醇诱导的ONFH模型大鼠BMSC成骨分化的影响，结果表明，BMSC来源外泌体可通过上调SOX9蛋白水平促进BMSC的成骨分化。Wnt/β-catenin信号通路是Wnt信号传导途径中的经典通路，在ONFH的治疗中具有重要作用。Zuo等[41]研究发现，BMSC来源外泌体可以通过激活Wnt/β-catenin信号通路，恢复受损BMSC的功能，加速BMSC的DNA修复，解除BMSC的增殖抑制，恢复BMSC的分化潜能。Liao等[42]在ONFH模型家兔中经尾静脉滴注了转染miR-122-5p的BMSC来源外泌体，结果显示家兔股骨头的骨密度、骨小梁体积和骨小梁板厚度均有所增加，坏死的股骨头愈合速度加快。BMSC来源外泌体具有较强的促进成骨分化与调控血管生成能力，同时也是重要的外泌体来源，其在ONFH治疗中具有巨大的潜力。

3.3.2滑膜间充质干细胞来源外泌体 滑膜间充质干细胞(synovial mesenchymal stem cell，SMSC)是成体干细胞之一，具有增殖及多向分化能力，可向骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞和肌腱纤维细胞分化[43]。SMSC来源外泌体能够促进软骨细胞增殖和迁移，抑制细胞凋亡，对骨组织起到修复作用[44]。Tao等[45]研究发现，SMSC来源外泌体中含有Wnt5a与Wnt5b蛋白，可通过调控Wnt5a/Yes相关蛋白信号通路促进软骨细胞增殖。郭尚春[46]研究发现，在激素性ONFH模型大鼠体内注射SMSC来源外泌体后，能有效缓解激素诱导的细胞增殖抑制、细胞凋亡与骨组织损伤等ONFH病理改变；而体外实验结果显示，SMSC来源外泌体可被BMSC摄取，促进BMSC细胞增殖，并对由血清饥饿诱导的细胞凋亡起抑制作用。Guo等[47]研究发现，将SMSC来源外泌体注射到由糖皮质激素诱导的ONFH模型大鼠体内，可有效减少大鼠骨小梁丢失、骨髓坏死和脂肪细胞积累，改善大鼠股骨头的骨密度与骨小梁微观结构，同时还可以逆转糖皮质激素导致的细胞凋亡和增殖抑制，增加股骨头中成骨细胞的数量，改善ONFH。因此，在ONFH早期采用SMSC来源外泌体治疗，能够促进成骨细胞、软骨细胞与BMSC增殖，抑制细胞凋亡，进而改善ONFH。

3.3.3人脐带间充质干细胞来源外泌体 人脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cell，hUC-MSC)可以促进血管生成，预防糖皮质激素诱发的ONFH；hUC-MSC来源外泌体作为重要的旁分泌机制之一，可以抑制BMSC凋亡，增强骨形成与血管生成，治疗骨损伤[48-50]。Kuang等[51]研究发现，Wharton’s jelly组织的hUC-MSC来源外泌体对糖皮质激素诱导的ONFH具有良好治疗作用；进一步机制研究发现，Wharton’s jelly组织的hUC-MSC来源外泌体可通过miR-21-PTEN/AKT信号通路抑制凋亡蛋白BAD和Caspase3，逆转糖皮质激素引起的细胞凋亡作用，促进骨细胞的增殖。

3.3.4其他间充质干细胞来源外泌体 Wang等[52]研究发现，在骨关节炎模型小鼠的关节内注射胚胎间充质干细胞来源外泌体，能够阻止小鼠关节内的软骨破坏；进一步研究发现，胚胎间充质干细胞来源外泌体可通过增加Ⅱ型胶原的合成和降低细胞外基质降解酶ADAMTS5的表达缓解软骨细胞外基质代谢失衡。Liang等[53]研究发现，人脂肪间充质干细胞来源外泌体中富含miR-125a，而miR-125a能够通过靶向3’非翻译区来抑制血管生成抑制剂Delta-like4的表达，促进内皮尖端细胞形成，调节内皮细胞的血管生成，提示人脂肪间充质干细胞来源外泌体可作为一种促血管生成因子参与各类组织的修复。Liu等[54]研究发现，多能干细胞诱导的间充质干细胞来源外泌体能够通过激活内皮细胞中的PI3K/AKT信号通路，预防骨丢失，同时可以显著增强内皮细胞的增殖、迁移和血管形成能力，增加股骨头微血管密度；提示多能干细胞诱导的间充质干细胞来源外泌体在ONFH的预防和治疗中发挥重要作用。因此，上述多种MSC来源的外泌体可通过细胞间的组织通讯，促进骨细胞与血管细胞的增殖，达到缓解骨组织破坏、促进骨与血管生成的目的，进而改善ONFH。

3.4 富血小板血浆来源外泌体富血小板血浆(platelet rich plasma，PRP)是新鲜全血离心后获取的血浆，富含多种生长因子，可诱导成骨与血管生成，加速骨损伤的愈合，抑制炎症反应和细胞凋亡，修复坏死骨组织[55]。PRP来源外泌体在骨组织、软骨组织与慢性创面修复中担任重要角色，具有强大的组织修复功能，且其具备稳定性高、生物兼容性好、易于规模化生产等诸多优点，成为开展外泌体研究的重点内容[56]。Tao等[57]在体外将PRP来源外泌体分别与人微血管内皮细胞、BMSC和成骨细胞MC3T3-E1置于大剂量激素环境中进行培养，结果显示PRP来源外泌体能够减弱地塞米松对人微血管内皮细胞、BMSC 和成骨细胞MC3T3-E1的抑制作用与凋亡效应；PRP来源外泌体能够拮抗地塞米松对血管内皮生长因子A的抑制，促进成骨相关蛋白的表达，维持BMSC的成骨分化能力，抵抗细胞凋亡，进而保护股骨头；将PRP来源外泌体用于甲泼尼龙琥珀酸钠诱导的ONFH模型大鼠，大鼠体内骨细胞凋亡得到缓解。因此，PRP来源外泌体能够干扰激素诱导的细胞凋亡和增殖抑制，进而促进骨与血管生成，改善股骨头血运，增强股骨头的骨强度和骨密度。

不同来源的外泌体作为信号分子运输的载体，在不同细胞之间发挥通讯交流的重要作用。外泌体能够大规模生产，易于收集，且在低温环境下可长期储存，同时还具备无细胞毒性、低免疫原性和靶向性等诸多优势，已成为新一代的天然纳米级递送系统[13,58-59]。多项研究表明，不同来源的外泌体应用于ONFH模型动物后，均能够发挥修复骨损伤、改善骨坏死的作用[42,60-61]；不同来源外泌体在治疗ONFH中参与多个靶点、多条通路的调控[40,46-47,51,54,57]。这些研究成果对于ONFH发病机制与靶向治疗的研究提供了重要的理论依据。此外，通过基因工程技术改造后的外泌体具备更强的靶向性和跨膜传递效率，将其作为药物载体能够提高药物的生物利用度，进而在ONFH的治疗中发挥更好的疗效[62]。

4 小 结

目前，临床上治疗ONFH的非手术或手术方法均不能令人满意，而对外泌体的研究为ONFH的诊治提供了新的研究方向。外泌体在血清中的含量以及外泌体内miRNA的差异性均能够反映ONFH的发生阶段，其作为诊断ONFH的生物标志物，具有较好的灵敏度和准确度。不同细胞来源的外泌体能够通过调控信号传导和相关基因表达影响骨细胞、血管细胞的增殖分化，进而影响骨重塑。然而，目前关于采用外泌体治疗ONFH的研究多局限于动物实验，尚缺少临床试验的相关报道，且对于不同细胞来源的外泌体的具体适用对象，尚无确切论述。因此，利用外泌体诊治ONFH，仍需开展大样本、多中心、前瞻性随机对照临床试验进一步深入研究，且需对外泌体的治疗剂量、安全用药等方面进行规范，以促进其临床转化。