牛支原体病实验室诊断技术研究进展

刘红燕，郭亚男，闫背背,，王建东，岳 康,，何生虎*

（1.宁夏大学 农学院，宁夏 银川 750021；2.宁夏农林科学院动物科学研究所，宁夏 银川 750002）

牛支原体（Mycoplasma bovis,M.bovis）是无细胞壁的原核生物，侵入机体后可导致多种临床症状，如肺炎、关节炎、角膜结膜炎、乳房炎甚至孕畜流产等[1-2]。牛支原体呈世界性分布，造成的经济损失难以估量[3]。1961年，牛支原体首次从有乳房炎的牛乳中分离出来，10多年后，研究确定了牛支原体可引发各类呼吸系统疾病[4]。2008年，我国首次从患病犊牛肺脏中分离到该病原体，随后我国10多个省市陆续发生了牛支原体病，严重影响了我国养牛业的发展[5]。在集约化牛场中，伴随着养殖规模的扩大，牛支原体的感染率和发病率也随之增加，给养殖企业造成了难以挽回的损失。因此，应用高灵敏度、高精确度的牛支原体快速检测技术尤为重要。目前，对牛支原体检测技术的研究主要有4个方面：病原学诊断方法、免疫学诊断方法、血清学诊断方法和分子生物学诊断方法。

1 病原学诊断方法

牛支原体感染后无示病症状，通常与巴氏杆菌、链球菌、肺炎克雷伯等其他病原菌混合感染，采用实验室诊断技术有助于确诊。检测和鉴定牛支原体可采用微生物培养方法，因为支原体结构简单，胆固醇、长链脂肪酸和生长因子等不能由自身提供，所以培养基中要加入血清、酵母浸出液、蛋白胨和葡萄糖等其他试剂；同时，培养基pH值须调至7.3～7.8，pH值低于7.0会抑制其生长。由于牛支原体基因组较小，生物合成途径有限，对营养和环境的需求比一般细菌高，因此要在培养基中加入20%马血清，置于含有5% CO2、37 ℃恒温箱中培养4 d左右，在光学显微镜下观察固体培养基，菌落会呈现出特有的“油煎蛋”形态。虽然分离鉴定法是诊断牛支原体病的“金标准”，但由于牛支原体人工培养难度大、生长周期长，费时费力，因此该方法存在一定的局限性[6]。

2 免疫学诊断方法

2.1 免疫组化

研究者通过免疫组化检测，发现机体感染牛支原体后会引起严重的肺部病变，肺间质扩大，外观呈现大理石样病变，并且在支气管上皮细胞表面和细胞质内均检测到牛支原体抗原。Rodríguez等[7]通过免疫组织化学方法评估了自然发生和实验诱导感染牛支原体肺炎后犊牛机体内炎性病变中环氧化酶的表达，结果显示牛支原体抗原位于呼吸道管腔和周围坏死组织的上皮细胞和炎症细胞中，并且在支气管、细支气管、肺泡上皮细胞和巨噬细胞中均检测到环氧化酶，结果显示环氧化酶蛋白在牛支原体感染期间过度表达，它始终与肺炎区域牛支原体抗原的存在有关。Nunoya等[8]利用免疫组织化学技术发现患牛支原体肺炎的犊牛肺组织有深红色实变区域，同时伴随有亚急性化脓性细支气管炎以及周围淋巴组织增生。该方法在肺炎病灶的细支气管上皮细胞表面、细胞质和细支气管吞噬细胞的细胞质中均发现牛支原体抗原存在。

2.2 免疫印迹

牛支原体膜蛋白种类丰富，包括VSP家族成员、pMB67、P26、P30和P48等抗原蛋白。目前学者普遍认为，牛支原体导致的呼吸道感染具有大量免疫病理学成分，其特征是感染组织中淋巴细胞大量积聚、炎细胞因子和肺部炎症出现。Chen等[9]利用免疫印迹法对牛支原体进行定量和定性检测，结果显示P27是牛支原体的膜蛋白，这有助于了解牛支原体的分子致病机制。Kumar[10]通过免疫印迹法区分牛支原体（M.bovis）和无乳支原体（Mycoplasma agalactiae）的免疫原性蛋白，发现这2种支原体的蛋白质谱几乎相似，存在许多发生交叉反应的多肽，但可以用特异性免疫原性蛋白进行区分。

3 血清学诊断方法

3.1 ELISA

血清学诊断是检测牛支原体的有效方法，其特异性和灵敏性都较高。Fu等[11]基于重组P48蛋白和单克隆抗体（10E）建立了直接竞争ELISA方法，并且与其他病原体无交叉反应。通过对比试验，发现这种直接竞争ELISA方法的阳性检出率高于商品化间接ELISA试剂盒的检出率。胡国明[12]将P48蛋白纯化后包被在96孔板上检测单克隆抗体效价，其效价可达640 000左右，并且与其他病原体无交叉反应，具备特异性高、稳定性强等优点。Han等[13]将蛋白作为包被抗原，检测牛支原体的特异性抗体，从而建立了检测该病原体的ELISA方法。在此方法基础上，研发出了硫氰酸钠（NaSCN）竞争ELISA法，用于检测IgG亲和力，成功建立起了能区分免疫牛和感染牛的检测方法，并且能可靠评估牛支原体感染程度和疫苗效价。ELISA检测方法操作简单、快速，在调查大规模流行病学时具有显著优势。

3.2 胶体金

胶体金免疫层析法是20世纪80年代诞生的一项快速检测技术，它是以胶体金作为示踪物，用于抗原抗体结合反应的免疫标记技术。简莹娜[14]基于牛支原体分离菌株的P48重组蛋白，构建了胶体金免疫层析试纸条检测方法，该试纸条检测牛支原体高免血清效价可至1∶106。与间接血凝试验法相比较（IHA），胶体金免疫层析法阳性检出率和阴性检出率都在93%以上，具有检测速度快、灵敏度高、特异性强等优点，适用于牛支原体的快速检测。周华倩等[15]利用牛支原体重组膜蛋白P48和P80双抗原建立了免疫胶体金抗体检测试纸条方法，该方法可以检出人工感染和接种疫苗2周后牛血清中的支原体抗体。通过最低检测下线、交叉反应性和人工感染血清检测等试验发现，该试纸条的特异性和敏感性较好，适用于临床血清中牛支原体的快速检测。胶体金免疫层析法不需要实验室仪器和专业人员，操作简单，数分钟内便可得到可视化结果，更适合于生产一线的现场应用。

4 分子生物学诊断方法

4.1 普通PCR及荧光定量PCR方法

分子生物学诊断方法是牛支原体实验室诊断中的最常用方法。PCR技术比其他检测方法具有更高检测效率，它是鉴别牛支原体与其他支原体的一项重要检测技术[16]。当前基于牛支原体P48、P80和Polc等为靶基因建立的PCR检测方法取得了优异的检测效果[17]，因此市售检测试剂盒不断研发出来。包世俊等[18]依据牛支原体脂蛋白P48基因序列，设计了一对具有特异性的引物，建立了牛支原体的PCR检测方法。结果显示，常见病原菌的DNA样品无相应的扩增条带，其可检测出的牛支原体DNA最低下限浓度约为0.002 875 ng/mL，该方法的检出率与病原分离率一致。翟肖辉等[19]将牛支原体P80基因作为靶基因，设计出了qPCR特异性引物及探针，建立了牛支原体的TaqMan探针检测方法，最低检测下限为3.89 copies/μL，其灵敏度是普通PCR的4～10倍，为牛支原体的快速诊断和核酸定量检测提供了方法。该方法具有检测速度快、定量准确、灵敏度高等优点，为各类疫病防控奠定了基础。

4.2 多重PCR方法

Parker等[20]根据牛支原体基因，设计了特异性引物，建立了一种多重PCR方法，同时检测鼻拭子、奶样和精液中的牛支原体。结果显示，PCR检测线最低的是奶样，其次是鼻拭子和精液。杨莉等[21]利用牛支原体oppD基因序列、牛多杀性巴氏杆菌Pm-kmt基因序列和牛结核分枝杆菌IS6110基因序列，设计出了3对特异性引物，建立起多重PCR检测方法。结果表明，该方法能同时对这3种病原体的靶基因进行扩增，特异性强、灵敏度高，并且可以对单一感染和混合感染进行鉴别诊断。邢小勇等[22]基于牛传染性鼻气管炎病毒（IBRV）gB基因、牛支原体P48基因和肺炎克雷伯（KP）khe基因，设计了3对特异性引物，从而建立起检测这3种病原体的多重PCR技术。结果显示，IBRV最低检出量为103TCID50，牛支原体最低检出量为6.5×101cfu，KP的最低检出量为8.1×101cfu，并且该方法与牛群中常见的其他病原体无交叉反应。与传统PCR方法相比较，多重PCR方法操作简便，只需要加样1次，运行1次反应程序，便可检测出多种病原体，具有成本低、检出结果快等优点。

4.3 等温扩增技术

环介导恒温扩增技术（LAMP）是21世纪初诞生的一种新型核酸扩增技术。该方法操作简单，不需要实验室专业仪器，在60 ℃左右的等温条件下，便可实现核酸扩增，其扩增效率是传统PCR方法的10倍以上。Itoh等[23]将超快速提取技术和环介导恒温扩增技术相结合，建立起更简单、更快速、更灵敏的方法检测牛奶中的牛支原体。结果表明，该方法可以在120 min内得到检测结果，对罐装奶、初乳以及乳腺炎奶均适用。范晴等[24]基于牛支原体和牛传染性鼻气管炎病毒（IBRV）的保守基因序列，设计了2对特异性的LAMP引物，建立了能够检测牛支原体和IBRV的双重荧光LAMP检测方法。结果显示，该方法与其他病原体无交叉反应，最低检测线可达到100 copies/μL。环介导恒温扩增技术具有灵敏度高、特异性强、稳定性好等优点，可用于临床大量样本的检测，但存在假阳性高的缺点，虽然目前已经找到措施对其进行优化，但仍需进一步验证[25]。

RPA技术利用重组酶与引物结合形成DNA复合物，对模板中的靶基因进行对数式扩增，在数分钟内便可得到扩增产物。翟肖辉等[26]利用牛支原体P80基因序列，设计了特异性引物和探针，对反应条件进行优化，建立了牛支原体的RPA检测方法。最后将RPA与侧向流（LF）试纸条结合，形成LF-RPA检测方法，其最低可检测基因组DNA 5 pg/μL，与荧光定量PCR检测结果符合率为94%。该方法可现场操作，检测结果可视化，为牛支原体快速检测提供了技术支持。Li等[27]基于牛支原体的uvrC基因，建立了荧光检测的RPA技术（实时RPA）与测流试纸条（LF）相结合的检测技术，最低检测线为1.0×101copies/μL，与荧光定量PCR检出率一致。该方法未与其他病原体发生交叉反应，可有效检测牛支原体。

5 小结与展望

现阶段牛支原体的实验室诊断技术已经取得了较大进展，但每种诊断方法都存在着一定程度的局限性，在进行诊断时，可以综合考虑多种因素进行选择，多种诊断方法联合检测以提高牛支原体诊断的精确度。随着研究者对牛支原体的研究不断深入，快速、准确、新型的诊断技术逐渐被报道，为牛支原体的诊断提供了科学依据。相信未来会有更多可靠、灵敏、成本低的诊断技术出现，为牛支原体病的防控奠定坚实基础。