GLAST与神经系统疾病的研究进展

吴芳杉马科锋崔 博*

(1.军事科学院军事医学研究院环境医学与作业医学研究所,天津 300050;2.潍坊医学院公共卫生学院,山东 潍坊 261053)

谷氨酸是一种神经系统兴奋性神经递质,它可以启动快速信号转导,参与学习、记忆以及突触可塑性[1-2]。然而若细胞外谷氨酸异常堆积,过度刺激谷氨酸受体,可导致Ca2+和Na+持续内流,细胞内钙超载,水分增加,进而造成细胞毒性水肿,神经元变性死亡等[3]。这会造成一系列的神经系统疾病,如:帕金森病、阿尔茨海默病、癫痫等[4]。显然,维持谷氨酸稳态是抵抗谷氨酸兴奋性毒性的有效途径。

Na+依赖的兴奋性氨基酸转运蛋白(excitatory amino acid transporters,EAAT)是细胞外谷氨酸转运的重要蛋白,起到谷氨酸再摄取的作用,维持细胞外间隙谷氨酸水平的稳定。目前,EAAT已被克隆出Na+依赖的5种亚型:EAAT1(GLAST)、EAAT2(glutamate transporter-1,GLT-1) 、EAAT3(excitatory amino acid carrier,EAAC1)、EAAT4和EAAT5[5-6]。在中枢神经系统中GLAST和GLT-1主要在星形胶质细胞中表达,EAAC1、EAAT4和EAAT5主要在神经元中表达[7]。在神经系统中,一些谷氨酸转运蛋白的定位与表达在不同脑区可能是不同的,调控谷氨酸传递的作用也是不同的[8]。其中,星形胶质细胞通过GLT-1和GLAST摄取突触间隙中高达80%的谷氨酸[3]。生理情况下,GLAST再摄取谷氨酸的能力略次于GLT-1,但是当GLT-1再摄取能力被阻断时,GLAST再摄取谷氨酸的能力却增加了[9]。对于谷氨酸的调控是预防兴奋性毒性的关键,而谷氨酸转运蛋白如GLAST的调节恰恰是其中的关键一环。

1 GLAST结构与功能

早期研究发现,GLAST在分子学层面是一种膜拓扑学结构,可能由6个跨膜的α-螺旋和4个较短的跨膜结构域形成1个β-折叠结构[10]。GLAST的人类同源物为EAAT1,人类基因根据SLC家族命名,SLC1A3编码EAAT1[11]。其在小脑中表达最高,定位于星形胶质细胞膜表面[12]。

GLAST是一种膜溶质载体蛋白,它通过转运三个钠离子(Na+)和一个质子(H+)以及反向转运一个钾离子(K+)来介导细胞对谷氨酸的再摄取,以参与神经元兴奋性毒性损伤的调节[13-14]。GLAST与GLT-1重摄取胞外谷氨酸,在谷氨酰胺合成酶(Glutamine synthetase,GS)的作用下转变为无毒的谷氨酰胺。而目前发现似乎GS只定位在星形胶质细胞上。在细胞外没有发现专门用于分解谷氨酸的酶。细胞外谷氨酸可以维持在正常水平完全依赖于Na+依赖的谷氨酸转运蛋白[3]。在外周神经系统中则主要是GLAST的再摄取作用。GLAST作为调节胞外谷氨酸浓度的主要转运蛋白之一,其在谷氨酸兴奋性毒性的调节方面,作用不容小觑。

2 GLAST与神经系统疾病

在神经系统中,兴奋性神经元与抑制性神经元维持平衡,才可以使神经系统维持正常功能。平衡被打破,然后造成一系列的神经系统病变。正常情况下,胶质细胞中谷氨酸转运蛋白可以维持谷氨酸稳态,阻止谷氨酸兴奋性毒性损伤[15]。若胶质细胞对谷氨酸的再摄取和反应能力受损,会产生相应神经系统疾病[16]。

2.1 GLAST与中枢神经系统疾病

2.1.1 GLAST与帕金森病(Parkinson’s disease,PD)

PD是一种常见的神经系统变性疾病,中脑黑质多巴胺(Dopamine,DA)能神经元的变性死亡是其典型的病理改变[17]。而多巴胺缺乏会导致丘脑底核的去抑制,丘脑底核神经元为黑质致密部中含有谷氨酸受体的DA能神经元提供兴奋性神经支配,其中谷氨酸作为兴奋性递质的角色存在。这又加重了DA能神经元的变性[18]。说明谷氨酸稳态失衡与帕金森病发病机制相关。谷氨酸被释放到细胞外,作用于突触后受体发挥作用。N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartate,NMDA) 受体是最有代表性的介导兴奋性毒性的离子型受体之一,过度活化的NMDA受体引起大量Ca2+流入神经元,最终引起DA能神经元损伤。临床上NMDA受体拮抗剂药物的应用,表明抑制谷氨酸能过度活化是治疗帕金森病的有效策略[19]。Salvatore等[9]发现,在PD模型中,黑质纹状体神经元丢失,谷氨酸浓度增加,GLT-1介导的主要的谷氨酸再摄取途径被阻断,然而却发现GLAST的再摄取能力出现短暂增强,也增加了整体谷氨酸摄取能力。这可以抵抗发病初期谷氨酸浓度的增加,使神经元损伤得到缓解,这为GLAST介导的谷氨酸再摄取提供了新思路。

2.1.2 GLAST与阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)

AD是一种以认知功能下降为主的神经系统退行性疾病,一般起病时不易被察觉。AD发病时,病理上表现为神经元变性丢失和淀粉样蛋白斑块的形成[20]。中枢神经系统的兴奋性调节主要靠星形胶质细胞调节Na+依赖的兴奋性氨基酸转运蛋白GLT-1和GLAST来实现的[21]。Schallier等[22]研究发现8月龄APP23小鼠皮层和海马中,GLAST和GLT-1表达降低,而皮层中囊泡谷氨酸转运蛋白1(the vesicular glutamate transporters,vGLUT1)表达显著增加。谷氨酸释放增多、转运蛋白表达减少,理论上细胞外谷氨酸浓度是增加的。但是与野生型小鼠相比,其细胞外谷氨酸水平是降低的,说明谷氨酸转运蛋白的活性可能并不只受到表达变化这一种调控。而18月龄APP23小鼠皮层和海马中GLT-1表达与野生型小鼠相比是降低的,但是GLAST的表达基本不变,这表明AD中谷氨酸改变可能主要通过GLT-1实现,但是显然在AD发病初期,GLAST也是参与其中的。Han[23]等研究发现Aβ1-42的低聚物可以降低EAAT1的表达,而胰岛素可以恢复这一趋势,提高EAAT1的表达。而目前人们已认可淀粉样蛋白β1-42(Aβ1-42)是AD的潜在生物学标志物之一[24]。AD因与糖尿病具有许多共同的病理特征,被称为“3型糖尿病”,胰岛素信号传导受损出现在AD早期阶段,胰岛素对于AD有一定的保护作用[25]。由此可见,EAAT1在AD的预防与治疗方面都有潜在作用[26]。

2.1.3 GLAST与癫痫(Epilepsy)

癫痫发作代表着整个兴奋性神经元群的同步放电失控,会导致大量谷氨酸释放和兴奋性神经毒性[27]。早在1993年,During等[28]通过微透析探针的方法检测发现癫痫患者发病时透析液中谷氨酸盐浓度持续增加,从而指出谷氨酸浓度过高与癫痫发病机制相关。Watanabe等[29]发现,诱导谷氨酸转运蛋白GLAST缺陷小鼠模型会导致癫痫发作。Doi等[30]发现点燃癫痫模型中,完全点燃的SD大鼠在最后一次癫痫发作1 d和30 d分别检测海马GLAST、GLT-1等的表达,发现在1 d它们表达均显著升高,而30 d谷氨酸转运蛋白与对照组相比没有变化。这些结果表明GLAST、GLT-1等可能参与了癫痫的发生,但是与癫痫的维持状态无关。Sun等[31]发现,Neo1(neogenin)在癫痫患者海马中表达是降低的,动物模型中显示Neo1条件性敲除(Neo1KO)会增加小鼠癫痫易感性,而Neo1KO鼠海马星形胶质细胞中GLAST也是降低的。免疫共沉淀显示Neo1KO与GLAST形成了复合物。过表达Neo1 GLAST恢复;过表达GLAST可以恢复谷氨酸摄取和谷氨酰胺合成,并且降低了癫痫反应。由此可见,GLAST表达的变化与癫痫发作密切相关,很有可能是癫痫的易感因素之一。Taspinar等[32]研究发现点燃癫痫模型中,GLAST等表达在前期增加,但再摄取谷氨酸时间延长,说明增加的谷氨酸转运蛋白的表达已不足以清除多余的谷氨酸。而丙戊酸或头孢曲松治疗组,GLAST蛋白表达是增加的,并将再摄取时间缩短到几乎和对照组相当,说明丙戊酸或头孢曲松可能是通过增加GLAST等谷氨酸转运蛋白的表达,来调节谷氨酸,进而治疗癫痫的。

2.2 GLAST与外周神经系统疾病

2.2.1 GLAST与视网膜病变

研究发现视觉、听觉感受器的突触功能是有调节性的,需要感受细胞持续、分级释放囊泡,由此进化出带状突触结构[33]。光感受器的带状突触结构持续性释放谷氨酸,使突触间隙谷氨酸持续升高,持续有效的谷氨酸摄取显得尤为重要,因此在视网膜中EAAT是高度表达的。Müller细胞是调节细胞外递质、保持突触正常传递的重要细胞,视网膜的谷氨酸摄取主要是通过Müller细胞上的GLAST实现的[34]。研究表明GLAST缺陷小鼠出现了正常眼压青光眼样表型,表明GLAST功能障碍可能是青光眼患者视网膜神经节细胞(retinal ganglion cell,RGC)丢失的原因[35]。Ma等[36]发现高糖环境,活性氧产生增加,降低了GLAST的表达,降低了Müller细胞对谷氨酸的摄取。于是通过继续下调TRPC6通道,抑制高糖条件下活性氧的产生,发现这种情况下促进了GLAST的表达,提高了高糖条件下Müller细胞对谷氨酸的摄取活性,减缓了视网膜损伤,证明GLAST对RGC的保护作用。

2.2.2 GLAST与听力损失

耳蜗中存在重要的谷氨酸循环机制:谷氨酸自内毛细胞释放后,由耳蜗支持细胞上的GLAST再摄取到支持细胞中,在谷氨酰胺合成酶的作用下谷氨酸转变为无毒的谷氨酰胺。谷氨酰胺被释放出细胞后,又被内毛细胞摄取,在磷酸化的谷氨酰胺酶的作用下变为谷氨酸,来填补谷氨酸递质池,完成谷氨酸-谷氨酰胺循环[37-38]。谷氨酸过度堆积,产生兴奋性毒性,造成耳蜗带状突触损伤[39]。GLAST作为此循环的重要转运蛋白可以维持细胞外谷氨酸平衡,避免耳蜗细胞的兴奋性毒性损伤[40]。因此,GLAST缺陷小鼠提供了一个体内模型,用于研究听力损失的兴奋性毒性机制。Hakuba等[41]发现,GLAST缺陷小鼠外淋巴液中谷氨酸的浓度增加,其听力损失会加重,这与GLAST参与的谷氨酸循环被抑制有关。Tserga等[42]发现GLAST敲除小鼠与野生型小鼠相比,听性脑干反应(auditory brainstem response,ABR)Ⅰ波振幅降低,小鼠突触对减少。最近研究发现短时中等强度的噪声暴露会导致暂时性听力阈移,损伤耳蜗带状突触,这一般认为是谷氨酸毒性造成的[43]。研究中发现小鼠在噪声暴露后先出现GLAST增高趋势,虽然并无显著差异,但是在GLAST增高时兴奋性毒性是降低的。所以对于隐性听力损失中GLAST表达的深入研究是有必要的。

3 GLAST作用机制

目前对于GLAST调控机制的了解并不十分清楚,以往研究发现许多GLAST的正性和负性调控因子,也发现参与调控的相关通路,这表明GLAST是复杂的、多通路共同调节的。

3.1 JAK-STAT通路

JAK-STAT通路是多种细胞因子和生长因子的主要信号传导机制。一些研究发现JAK-STAT通路在神经系统疾病中发挥重要作用。JAK2和STAT3在神经系统胶质细胞和海马神经元中有表达,与一些神经退行性疾病的发展密切相关[44]。在单次延长应激(single-prolonged stress,SPS)干预的创伤后应激障碍(post-traumatic stress disorder,PTSD)的大鼠模型中,大鼠脑脊液中谷氨酸浓度升高,GLAST表达降低,JAK/STAT 3通路被抑制。而成纤维细胞生长因子2(Fibroblast growth factor 2,FGF2)可以改善这一现象[45]。说明FGF2可能也是GLAST的正性调控因子,并且可能是通过JAK/STAT通路来调节GLAST的。在大鼠注射红藻氨酸(kainic acid,KA)诱发的癫痫模型中发现,与未进行任何处理的对照组相比,p-JAK1和p-STAT3的表达有所增加,GLAST的表达也是增加的;而与KA或NC+KA(NC:空白载体)相比,过表达UCA1(一类长链非编码RNA)组抑制了p-JAK1和p-STAT3的表达,也抑制了海马星形胶质细胞中GLAST的表达[46]。许多研究提示谷氨酸通过激活STAT3(p-STAT3) 在触发GLAST表达上调中起作用,JAK/STAT失活抑制星形胶质细胞功能[45-47]。

3.2 DAG-PKC通路

研究发现,鸡的贝格曼胶质细胞谷氨酸暴露培养后,PKC激活剂可显著降低GLAST转运蛋白的活性,并降低其mRNA水平;而PKC抑制剂可以阻断这种变化。且发现谷氨酸受体激活介导了chglast启动子的转录活性[48]。GLAST长期调节显然涉及转录调控。Gosselin等[49]发现PKC的激活导致星形胶质细胞谷氨酸转运减少,与 EAAT1分布发生变化有关;并证明PKC控制EAAT1到细胞外微泡的途径。

3.3 P38-MAPK通路

Yadav等[50]综述中指出肌萎缩侧索硬化的致病机制有多种,其中包括谷氨酸兴奋性毒性。而p38-αMAPK主要调节p38 MAPK通路激活产生的一些对机体不利影响,其中包括调节兴奋性毒性、活性氧反应和神经元凋亡等。可见,p38-αMAPK的上调与谷氨酸兴奋性毒性之间存在调节关系。Wu等[51]发现糖尿病视网膜病变状态下GLAST和GS的表达下调。Raf-1激酶抑制蛋白(Raf-1 kinase inhibition protein,RKIP)的表达导致GLAST表达上调,提示RKIP与兴奋性毒性调节有关。而研究中还表明RKIP调节p38-MAPK信号通路。但是GLAST与MAPK之间是否有直接调节关系还需进一步研究。

3.4 NF-κB通路

Karki等[52]发现GLAST启动子区域含有两个NF-κB结合位点,在EGF诱导大鼠和人星形胶质细胞EAAT1(或啮齿类动物中的GLAST)表达中,NFκB也起关键作用。过表达NF-κB p65增加了EAAT1启动子的活性,也增加了EAAT1mRNA和蛋白质水平。过表达NF-κB抑制剂降低了EAAT1启动子活性、mRNA和蛋白质水平。且在大鼠星形胶质细胞和人星形胶质细胞H4细胞中效果相同。研究结果表明,NF-κB对于EAAT1(GLAST)起正性调节作用,通过激活NF-κB途径,诱导其与EAAT1启动子结合,来正向调节表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)对EAAT1表达的促进作用。Karki等[53]首次证明阿伦酸是通过激活NF-κB途径来增强EAAT1的表达和功能。NF-κB途径可能是调控EAAT1表达与功能的关键之一。

3.5 GLAST的重要调控因子

GLAST的转录调控中一些因子发挥着重要作用。转化生长因子α(transforming growth factor-α,TGFα)、表 皮 生长 因子(epidermal growth factor, EGF)、碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor, bFGF)、胰岛素样生长因子-1(insulinlike growth factor-1,IGF-1)和胶质细胞源性神经营养因子(glial cell line-derived neurotrophic factor,GDNF)等能增加GLAST的mRNA和蛋白水平,起到正性调控的作用[54]。锰诱导的神经毒性模型[52]中,EAAT1 mRNA和蛋白质水平降低,转录因子YY1(Ying Yang 1,YY1)缺失减弱了这一表现,过表达YY1导致这一现象。Karki等[52]发现YY1是EAAT1的关键阻遏因子,锰对EAAT1表达的抑制作用通过YY1介导。此外,YY1还招募组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase,HDAC) 共同抑制EAAT1以阻断NF-κB与EAAT1启动子结合引发正性调控作用。阿伦酸通过抑制锰诱导的YY1表达而解除了YY1对EAAT1的抑制[53]。Pajarillo等[55]研究中发现17β-雌二醇和他莫昔芬可以逆转锰对GLAST表达和功能造成的影响,而TGF-α可能是这一保护机制的重要介质。以上众多因子参与GLAST调控过程,但是参与GLAST调控的远不止于此,还需进一步探索。

4 结语

谷氨酸毒性的调控是复杂的,多方面相互作用调节的。谷氨酸转运蛋白的表达失衡是关键之一,它与多种神经系统疾病的发病机制密切相关。因此阐明GLAST的作用机制对进一步了解谷氨酸兴奋性毒性至关重要。GLAST在啮齿动物的耳蜗中也有表达,中枢神经系统中的谷氨酸-谷氨酰胺循环与耳蜗中的谷氨酸-谷氨酰胺循环本质上是相似的。因此对GLAST与神经系统疾病的相关进展进行阐明,有望为听力领域GLAST的研究找到新思路。