长链非编码RNA影响舌鳞癌侵袭转移的机制研究

邓永琴 胡燕 叶栋

舌癌是最常见的口腔癌，发病率逐年增加且趋于年轻化[1]。舌鳞癌（tongue squamous cell carcinoma，TSCC）是舌癌的主要类型，约占90%，恶性程度高，早期可发生淋巴结转移，中晚期患者5年生存率仅27%[2]，酒精、烟草和HPV 感染等被认为是诱发TSCC的重要因素[3]。肿瘤的侵袭转移是恶性肿瘤发展的重要过程，也是影响多数肿瘤患者生存结局的主要原因，其相关机制相当复杂精细。长链非编码RNA（long noncoding RNA，lncRNA）是一类非蛋白编码功能的转录本，不仅参与基因表达和多种生理过程，也在肿瘤的发生、发展过程中发挥调节作用。近年来，越来越多的研究表明lncRNA 参与了肿瘤的生物过程，作用机制包括直接与基因相互作用参与转录过程、作为信号分子介导基因特异性表达、控制转录后稳定性等[4-5]。Fan 等[6]发现，膀胱癌组织中lncRNA 可通过靶向改变下游基因表达促进肿瘤侵袭转移。Yang 等[7]发现TSCC 患者lncRNA 表达失调，由此导致的肿瘤微环境改变及信号通路异常调控是肿瘤细胞转移侵袭的主要原因之一。lncRNA 广泛分布于血液、尿液、唾液等体液中，稳定性较高，在组织或细胞中特异性表达，因此可作为肿瘤诊断的生物标志物，在各种肿瘤诊断方法中具有非侵入性检测的优势[8]。本文探讨lncRNA在TSCC 中的不同调控机制，分析TSCC 病理过程，揭示TSCC 侵袭转移的相关分子机制，为明确TSCC 早期诊断生物标志物、抑制其恶性生物学过程和促进靶向治疗提供新的思路。

1 lncRNA概述

人类基因组测序发现，人类基因组大部分被转录，但仅不足2%能编码蛋白质。基因组中那些长度超过200 个核苷酸、不参与蛋白质翻译过程的RNA 序列被叫做lncRNA[5]。lncRNA 并不是转录本的“垃圾”，而具有重要的生物学功能。研究发现，lncRNA 可通过募集基因的调节因子调控其表达，或直接剪切RNA 发挥局部基因调控作用；与转录启动子相互作用的lncRNA 可增加或抑制基因转录起始位点，从而正反馈基因的转录；lncRNA 还可竞争微小RNA（microRNA，miRNA）的结合位点，参与基因的翻译过程[9]。目前，随着高通量测序技术的发展，lncRNA 影响多种肿瘤进程的机制研究也日益清晰。Liu 等[10]发现，食管鳞状细胞癌中，lncRNA 通过结合并稳定6-磷酸果糖-2-激酶/果糖-2，6-二磷酸酶3 的活性来激活糖酵解，从而促进肿瘤进展。TSCC 的侵袭转移和其他肿瘤一样，主要与肿瘤微环境的改变相关，包括上皮-间质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）及细胞外基质（extracellular matrix，ECM）降解等，介导肿瘤细胞从稳定向不稳定转变[11-12]。lncRNA 可诱导TSCC 细胞发生EMT 及ECM，并通过影响外泌体运动促进细胞侵袭转移[13]。

2 lncRNA影响TSCC的EMT进程

EMT 是指上皮细胞分化为间充质细胞，在机体伤口愈合、发育及干细胞行为中发挥重要作用。EMT 病理过程中，细胞链接减弱或消失，细胞骨架结构被重塑，细胞形态及运动轨迹改变，导致组织纤维化或激活癌症[14]。研究发现参与肿瘤细胞EMT 的因素包括关键蛋白E-钙黏蛋白（E-cadherin）和N-钙黏蛋白（Ncadherin）、转录因子zest 同源物增强子2（enhancer of zeste homolog2，EZH2）、Snail、和螺旋-环-螺旋因子（twist-related protein，TWIST）1 及信号通路Wnt/β-连环蛋白（β-catenin）、NF-κB 和磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶（phosphoinositide-3-kinase/threonine kinase，PI3K/Akt）等[15]。在TSCC 中，lncRNA 可通过内源性竞争miRNA 调控靶基因的表达、参与调节肿瘤的信号通路和影响基因翻译后蛋白的修饰等过程诱导EMT的发生，进而减弱肿瘤细胞间的紧密连接和黏附连接，增加癌细胞转移和扩散能力，从而加剧肿瘤的恶性生物学行为。

2.1 lncRNA 通过内源性竞争miRNA 诱导EMT miRNA 是一类长约22 个核苷酸的非编码RNA，可靶向转录本控制基因的表达，从而影响肿瘤细胞的稳态[16]。lncRNA 可内源性竞争miRNA，使miRNA 沉默，进而诱导EMT 的发生。lncRNA H19（H19）是位于19 号染色体长2.3 kb 的非编码RNA，作为母体印记基因表达的产物，H19 被报道在多种肿瘤（胆管癌、结直肠癌和多发性骨髓瘤等）中高表达[17]。在TSCC 细胞中，H19 可内源性竞争miRNA let-7a，激活高迁移率组蛋白（high mobility group protein，HMGA）2诱导肿瘤细胞发生EMT[18]。H19 也可通过与miRNA 相互作用调节EZH2表达来促进β-catenin 的活化，由此诱导TSCC 细胞发生EMT[19]。而在食管癌中，H19 表达明显上调，促使EZH2 表达，诱导EMT[20]；在膀胱癌中H19 不仅可与EZH2 特异性结合，还可激活β-catenin，诱导肿瘤细胞发生EMT[21]。lncRNA 尿路上皮癌相关（urothelial carcinoma-associated，UCA）基因1 是一种长1.4 kb 的非编码RNA，首次在人膀胱癌细胞中被发现[22]。Shi 等[23]发现，UCA1 可内源性竞争miR-138-5p，靶向调控CC 趋化因子受体7（CC chemokine receptor 7，CCR7），抑制E-cadherin 蛋白表达，诱导TSCC 细胞发生EMT。Zhang 等[24]分析67 组TSCC 组织及癌旁组织后发现，UCA1 还可内源性竞争miR-124，调节转化生长因子β（transforming growth factor β，TGF-β）1，诱导EMT，促进肿瘤细胞的增殖及迁移。除H19外，Hu 等[25]还发现lncRNA LINC01783（基因ID：100132147）在TSCC 癌组织中表达上调，内源性竞争性miR-199b-5p 并下调Ecadherin 表达，影响癌细胞EMT。此外，lncRNA 胃癌相关转录本（gastric cancer-associated transcript，GACAT）1在TSCC 组织中高表达，靶向调控miR-149，不仅可激活N-cadherin，诱导EMT 的进展，也可下调肿瘤细胞的凋亡和自噬过程，促进癌细胞的侵袭和转移[26-27]。不同lncRNA 协调miRNA 诱导TSCC 发生EMT的路径见表1所示。

表1 lncRNA协调miRNA诱导TSCC发生EMT的路径

2.2 lncRNA 作用于信号通路调节EMT 在TSCC 中，lncRNA 异常表达可触发癌细胞内Wnt/β-catenin 信号通路。lncRNA 转移相关肺腺癌转录本（metastasisassociated in lung adenocarcinoma transcript，MALAT）1 首次在非小细胞肺癌患者被筛选出来，具有剪接mRNA、影响转录和内源性竞争RNA 等多种生物学功能，高度保守。Liang 等[32]研究发现，MALAT1 在癌组织中的表达水平显著增高，并与肿瘤远处转移相关，其相关机制为MALAT1 激活Wnt/β-catenin 信号通路，诱导EMT。Zhong 等[33]报道lncRNA 心肌梗死相关转录本（myocardial infarction associated transcript，MIAT）可促进肿瘤侵袭和远处转移，其分子机制与激活Wnt/βcatenin 信号通路进而调节EMT 相关。此外，Yang 等[34]研究发现Wnt/β-catenin 信号通路也可被UCA1 激活。除Wnt/β-catenin 信号通路外，lncRNA 还可影响PI3K/Akt、NF-κB 信号通路。如lncRNA LINC00152 通过增强PI3K/Akt 信号通路活化过程[31]，Huang 等[36]报道一种NF-κB 相互作用的lncRNA（NF-κB interacting lncRNA，NKILA）在TSCC 组织中低表达，沉默NKILA 表达可抑制NF-κB 通路，进而逆转EMT。lncRNA 作用于信号通路调节TSCC发生EMT的分子机制见图1所示。

图1 lncRNA 作用于信号通路调节TSCC 发生EMT 的分子机制示意图

2.3 lncRNA 影响EMT 关键蛋白表达 lncRNA 可通过影响肿瘤细胞EMT 关键蛋白表达，导致细胞结构被广泛重组，促使细胞极性丧失、黏附性降低，加快癌细胞的侵袭转移。lncRNA HOX 转录本反义基因间RNA（HOX transcript antisense intergenic RNA，HOTAIR）全长约2.2 kb，位于12 号染色体，参与结直肠癌、肺癌、乳腺癌等癌细胞的转移[37]。Zhao 等[38]研究发现，与癌旁组织相比，HOTAIR 在TSCC 细胞中高表达，可直接激活HMGA2 蛋白表达，当沉默HOTAIR 时，E-cadherin 表达上调，提示HOTAIR 对肿瘤的恶性行为与EMT 相关。赵焱等[39]发现lncRNA 核仁小RNA 宿主基因（small nucleolar RNA host gene，SNHG）6 在TSCC 细胞中显著增高，而高表达的SNHG6与TSCC患者较差的预后相关，其相关机制可能是SNHG6靶向作用E-cadherin蛋白，从而促使癌细胞发生EMT。

3 lncRNA影响TSCC细胞外泌体运动

外泌体是细胞内吞的直径约为30～150 nm、具有脂质双层结构的囊泡，随着外泌体的胞间运动，其包裹的生物活性物质发挥了胞间通讯的作用，参与肿瘤细胞的发育过程。lncRNA通过影响外泌体运动影响癌细胞的侵袭转移[40]。qRT-PCR检测结果显示，lncRNA 肝细胞癌上调EZH2 相关（hepatocellular carcinoma up-regulated EZH2-associated，HEIH）蛋白在TSCC 细胞中的表达增加。Wang等[41]研究发现，TSCC细胞中HEIH 通过调控耐药外泌体，将SCC4/DDP 细胞株耐药性传递给敏感细胞进而影响肿瘤细胞的增殖、迁移及耐药性。在机制方面，荧光素酶报告基因实验证实HEIH 可与miR-3619-5p 结合，敲低HEIH 可下调miR-3619-5p 的下游靶点肝癌衍生生长因子（hepatoma-derived growth factor，HDGF）表达，提示HEIH 在抑制肿瘤细胞迁移和耐药中存在作用。该研究为TSCC治疗提供了新思路。

4 lncRNA影响TSCC的ECM进程

ECM 是一个高度动态过程，通过维持细胞表型、控制细胞黏附和运动来抑制细胞恶性进程；当ECM 沉积和降解平衡被打乱，肿瘤细胞随即发生侵袭和转移。研究发现，基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）可参与ECM 进程中各种蛋白质的降解，导致细胞结构重塑，还可释放活性因子促进肿瘤血管的生成[42]。MMP 的激活被认为是肿瘤侵袭和进展的重要因素之一。在TSCC 中，lncRNA 分化拮抗非蛋白编码RNA（differentiation antagonizing nonprotein coding RNA，DANCR）可通过激活MMP-2 和MMP-9 的表达降解ECM 并诱导肿瘤细胞的侵袭活动[43]。MMP-2 和MMP -9 又称明胶酶A 和明胶酶B，是ECM 蛋白主要水解酶，可降解纤维连接蛋白、纤溶酶原、蛋白多糖连接蛋白和层粘连蛋白[44]。作为Wnt/β-catenin 通路的下游靶基因，MMP-9 参与了UCA1 调控的Wnt/β-catenin信号通路，并在TSCC 的进展中起到作用[34]。此外，TSSC 组织中高表达的SNHG6 也可提高MMP-2 和MMP-9 表达水平，通过降低E-cadherin 蛋白水平来影响癌细胞的ECM 进程[45]。

5 小结与展望

lncRNA 通过多种途径参与TSCC 的侵袭转移过程，调控肿瘤的恶性生物学行为，其机制包括诱导TSCC 细胞发生EMT，影响外泌体运动和降解ECM 等。随着精准医疗的发展，高分子测序和基因芯片等技术的进步使铁死亡、自噬等细胞侵袭转移的分子机制探讨成为可能，结合lncRNA 探索TSCC 的新型生物标志物和靶向治疗是今后研究的方向。本文为进一步研究TSCC 侵袭转移分子机制、发病过程的早期诊断及靶向治疗提供了新的思路及方向。