玉竹组织培养外植体灭菌研究

胡亚龙李聪蔡任跃贺莹余国梁杨华

(1.湖南农业大学生物科学技术学院，湖南 长沙 410128；2.博观生物科技有限公司，湖南 长沙 410205)

玉竹(Polygonatum odoratum(Mill.)Druce)为百合科黄精属多年生草本植物，又名萎蕤、地管子、尾参等[1]。始载于《神农本草经》，明代李时珍以“萎蕤”之名将其列在《本草纲目》草部山草类[2]。玉竹根状茎入药，性味甘、微寒，有养阴润燥、生津止渴的功效[3]。玉竹不仅可以药用，在我国多个省份和其它国家还作为保健品、饮料、食品和化妆品等。玉竹含有多糖类、甾体皂苷类、黄酮类和生物碱、氨基酸，以及多种微量元素。药理研究表明，玉竹有降血糖、抗肿瘤、抗衰老和增强免疫力等功效，越来越受到人们的青睐。

玉竹在我国中药材市场中的份额不断攀升，其市场广、利润高，成为农民喜爱种植的中药材[4]。但玉竹的生产过程中，因人工选育，种资退化，不产生种子，所以通过组织培养快速大量繁殖玉竹良种种苗，成为解决种苗问题的有效途径[5]。玉竹组培外植体取自农田生长的植株，均带有微生物病菌，外植体表面灭菌是组培的重要步骤之一。同时，玉竹含糖量高，组织培养过程中更易滋生微生物，因此玉竹组织培养外植体灭菌研究显得尤为重要。笔者对不同杀菌剂，以及不同消毒方法的消毒效果进行研究，以筛选出适合玉竹组织培养的灭菌体系。本试验的目的在于降低玉竹外植体组织培养过程中的污染率，以获得足够的无菌材料，保证玉竹组培快繁体系研究的顺利开展。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试材料

试验材料为玉竹根茎，取自于邵东南国药都实验基地，选择生长健康的玉竹作为材料。

1.1.2 试验器材与试剂

XFH-30高压蒸汽灭菌锅(浙江新丰有限公司)、JP-100PLUS超声波清洗仪(深圳市洁盟清洁有限公司)、98%高纯度多菌灵(MACKLIN)、0.1%氯化汞(湖南农业大学实验试剂管理处)、次氯酸钠(汕头市莲塘化工有限公司)、乙酸(沪试化工有限公司)、MS培养基(国药集团化学试剂有限公司)、6-BA(茉钡特有限公司)、NAA(茉钡特有限公司)、植物凝胶(Coolaber)。

1.2 试验方法

1.2.1 灭菌处理

挑选健康玉竹根茎，切下芽尖作为组织培养外植体，每组100个，用无菌水预冲洗3次，分别进行处理,如表1所示；2个杀菌剂复合作用时，先浸泡A杀菌剂，无菌水冲洗3遍再泡B杀菌剂，浸泡完后再用无菌水冲洗3遍，每种灭菌方法进行3组重复。在消毒剂浸泡期间不时摇晃，使外植体与消毒剂充分接触。

表1 外植体灭菌方法

1.2.2 接种

经上述消毒处理后，将玉竹外植体放在无菌滤纸上吸干水分，转接至培养基上进行培养，接种培养基采用MS加6-BA 3mg·L-1加NAA 1mg·L-1加蔗糖10g·L-1加植物凝聚2.5mg·L-1，培养基(pH5.8)，培养温度为(25±2)℃，光照强度1500～20001x，光照时间12h·d-1[6]。

1.3 观察指标

培养期间，每天观察玉竹芽尖组织生长和污染情况，统计污染率和发芽率，其计算方法见公式：

幼芽污染率=(污染幼芽数/消毒幼芽数)×100%

(1)

幼芽成活率=(成活幼芽数/消毒幼芽数)×100%

(2)

1.4 数据处理

采用SPSS统计分析软件对试验数据进行方差分析及最小显著差异性检验，用Excel 2010进行数据整理和绘图。

2 结果与分析

2.1 单一杀菌剂对玉竹外植体的影响

由表2可知，分别用A组(0.2%多菌灵)、B组(10%次氯酸钠)、C组(0.1%升汞)浸泡玉竹外植体，相同作用时间，0.1%升汞处理后外植体污染率<10%次氯酸钠处理后外植体污染率<0.2%多菌灵处理后外植体污染率。结果表明，单一灭菌剂相同灭菌时间处理外植体时，0.1%升汞对玉竹外植体的灭菌效果优于0.2%多菌灵、10%次氯酸钠。说明升汞对玉竹外植体上的病原菌有较好的杀灭和抑制作用。这3种灭菌剂中，多菌灵的灭菌效果最差，可能是玉竹种植过程中长期使用多菌灵浸种导致病原菌对多菌灵产生耐药性。分析数据可知，随着玉竹外植体的污染率上升，成活率在下降，说明外植体一旦灭菌效果不好就会滋生病菌，从而导致外植体在组织培养过程中死亡。其中，C1组(0.1%升汞浸泡5min)灭菌效果最好，外植体污染率为8.33%，成活率为91.67%。升汞作为强力灭菌试剂，其灭菌效果好，灭菌较为彻底，且短时、高效[7]。但因其属于剧毒试剂，安全系数低往往在应用时较为受限。

图1 灭菌处理试验结果

2.2 杀菌剂复合使用对玉竹外植体的影响

由图1可知，分别用D组(0.2%多菌灵加0.1%升汞)、E组(0.2%多菌灵加10%次氯酸钠)、F组(10%次氯酸钠加0.1%升汞)浸泡玉竹外植体，3种处理方法对玉竹的外植体灭菌效果都比较好，但D、F组略优于E组。其中，F3组(10%次氯酸钠加0.1%升汞，分别浸泡15min)灭菌效果最好，外植体污染率为1.67%，成活率为96.67%。结果表明，2种杀菌剂复合使用时比单一杀菌剂的灭菌效果好，含有0.1%升汞的灭菌组合效果更佳。可以看出，杀菌剂复合作用时可有效解决外植体病原菌的耐药性问题，所以在玉竹的农业种植过程中可复合使用杀菌剂或者每年不同杀菌剂交替使用，可有效解决病原菌的耐药性问题。

表2 单一杀菌剂对玉竹外植体的影响

表3 杀菌剂复合使用对玉竹外植体的影响

2.3 杀菌时间对玉竹外植体的影响

由图1可知，在利用杀菌剂进行外植体表面灭菌时，随着浸泡时间增加，污染率会降低，但杀菌剂对外植体的伤害也会增加，植物体细胞受损越来越严重，导致外植体抵抗病原菌伤害的能力减弱，污染率逐渐上升，从而导致外植体的存活率降低。可以看出，并不是浸泡杀菌剂时间越久越好，浸泡时间太短则杀菌不充分，浸泡时间太长则对植物体细胞损伤过大，两者都会导致外植体死亡。该研究结果表明，外植体浸泡杀菌剂的时间在10～15min为宜。

2.4 超声波清洗对玉竹外植体的影响

表4 超声波清洗对玉竹外植体的影响

本实验G组和H组在A组和E组的基础上增加使用超声波清洗，结果表明，无论是单一杀菌剂还是2种杀菌剂复合处理，在结合超声波清洗后，都降低了外植体的污染率，提高了外植体的成活率。H3组(0.2%多菌灵浸泡15min，10%次氯酸钠浸泡15min，超声波处理15min)可使污染率降至3.67%，成活率为95.00%。由此可见,超声波处理对外植体灭菌能起到较好的优化效果。原因可能是经过杀菌剂处理后病菌活性降低，再通过超声波清洗可使病菌更易从外植体脱离，具体原因有待后续实验探讨。如果从实验室安全角度考虑，不含升汞的H3组可作为备用方案，其灭菌效果几乎和F3组相当。增加超声波清洗步骤，提升了外植体灭菌效果，同时可以替代毒性较大的含升汞的灭菌方案。

3 结论与讨论

研究结果显示，最优灭菌方案为F3组(10%次氯酸钠加0.1%升汞，分别浸泡15min)，污染率为1.67%，成活率为96.67%。将处理后的玉竹芽尖接种在培养基上，此时玉竹芽尖污染率低，生长迅速，且外植体成活状态好。本次选用的3种杀菌剂中，升汞对玉竹外植体上的病原菌有较好的杀灭和抑制作用，所以含有升汞的灭菌组合效果更佳。当2种杀菌剂复合使用时比单一杀菌剂的灭菌效果好。杀菌剂浸泡外植体的时间并不是越长越好，浸泡时间太长则对植物体细胞损伤过大，外植体浸泡杀菌剂的时间在10～15min为宜。外植体灭菌过程中增加超声波清洗步骤可提高灭菌效果，不含升汞的H3组(0.2%多菌灵浸泡15min，10%次氯酸钠浸泡15min，超声波处理15min)可作为备用方案，其灭菌效果比F3组略差，但方案的安全性更高。

外植体灭菌是植物组织培养能否成功的关键因素之一，因此找到一种快速、高效的外植体消毒方法，对于提高植物组织培养的效率和成功率至关重要。常用的消毒剂种类主要有次氯酸钠、次氯酸钙、过氧化氢、升汞、抗生素及硝酸银等[8]；其中，升汞的灭菌效果得到广泛认可，与本试验结论一致[9]。但是，升汞属于剧毒试剂，在实验操作过程中存在一定的危险性，很多实验室禁止使用，并且升汞不易采购。找到一种不使用升汞，同时灭菌效果突出的外植体灭菌方法一直是研究的热点。本试验通过杀菌剂复合使用并结合超声波清洗，给出了替代含升汞的灭菌方案，但是灭菌效果略差于含升汞的灭菌方案，此问题在今后的研究中有待继续优化。

随着人们对农药残留和环境保护的重视，对外植体进行化学除菌有一定的限制性，未来物理除菌可能成为研究的热点。对外植体进行物理除菌的方法包括光照、射线、紫外线、电离辐射、超声波清洗，其中超声波清洗除菌不会引起植株变异，未来可广泛应用于植物外植体灭菌[10]。Dukhouse等研究用频率20kHz和850kHz的超声波分别与次氯酸钠联合杀菌，杀菌效果表明，20kHz的低频超声与次氯酸钠同时作用时，除菌效果是最好的[11]。因此，未来可探究不同频率超声波的除菌的效果，找到最佳频率，使灭菌达到更好的效果，超声波清洗辅助外植体灭菌可以作为以后重点研究的方向。同时，超声波清洗配合杀菌剂使用达到良好的除菌效果其作用机理目前尚不清楚，笔者推断有多种不同原因。可能是超声波清洗使杀菌剂处理后的病原菌更容易从外植体上脱离；可能是超声波震荡使药剂更容易穿透病原菌的保护壳，从而杀死病原菌；也可能是超声波本身对病原菌有一定的影响，破坏了病原菌的自身结构，起到了杀菌作用。超声波清洗除菌的具体作用机理仍需进一步研究。

外植体灭菌是植物组织培养过程中重要的一环，一个优秀的灭菌方案是植物组织培养顺利开展的关键。为更好地进行玉竹组织培养，降低玉竹外植体组织培养过程中的污染率，保证玉竹快速繁育研究的顺利开展，笔者进行了本次试验探究。玉竹属于百合科黄精属植物，百合、黄精等同科属植物在进行植物组织培养时，都易受到病原菌的污染，本次试验结果在同科属植物外植体灭菌研究中也具有参考价值。