啮齿类动物种植体周围炎模型构建的研究进展及应用

戴雨薇，李 洁，孙媛元，吴轶群，孟 箭

种植体周围炎是种植体周围组织的病理状态，以种植体周围黏膜炎症和支持骨的进行性丧失为特征[1]。据报道，种植体十年累计生存率约为94.6%[2]，该生存率受种植体周围炎的影响，且将随着时间的推移而增加[3]。目前临床上种植体周围炎的治疗没有循证医学证据和有效方案[4]，因此深入研究种植体周围炎的发病机制、探索有效的治疗方案尤为重要。

虽然非啮齿类动物模型已经获得了有价值的信息，但由于各种条件的限制，它们并不具备进一步研究种植体周围炎发病机制的优势。本文将对啮齿类动物种植体周围炎动物模型的构建、研究进展及应用进行综述。

1 种植体周围炎动物模型构建的概述

1.1 非啮齿类动物模型

种植体植入模型已经成功地在不同的动物物种中被构建[5]。小型猪的牙周组织与人类的牙周组织有许多相似之处[6]，有研究人员利用猪来分析评价去皮瓣种植术后不同时间段种植体周围骨的炎症程度[7]。犬类也是较常用的动物模型，性格温顺，且在人体使用的植入物可以在犬身上直接测试，Park等[8]利用犬评估即刻种植构建周围炎模型的有效性，同时测试再生疗法治疗种植体周围炎的效果。兔也是研究牙周疾病炎症基础和愈合模式的常用模型。兔在相对较早的年龄就达到骨骼成熟，在进行更多的继发性骨重塑方面具有优势[9]。Sousa等[10]利用兔建立了钛表面污染的种植体周围炎的实验模型，但兔在骨成分和骨重建方面与人类的相似性较小[11]，且兔模型实验检测手段、技术相对受限。虽然非啮齿类动物牙齿的解剖结构与人类相似，但这些动物模型同时也具有价格昂贵，需要专门的饲养和维护设施等显著缺点。

1.2 啮齿类动物模型

与大型动物模型相比，啮齿动物的饲养成本相对较低，且在炎症过程中的相互作用方面已有了大量的研究数据[12]。因此，越来越多的学者选择啮齿类动物(主要是大鼠和小鼠)作为构建种植体周围炎的动物模型，本文将对此展开阐述。

2 近年来研究中构建的啮齿类模型

2.1 啮齿类动物的品系

在种植体周围炎啮齿类动物模型中C57BL/6J小鼠的应用最为广泛。Hiyari等[13]分别用C57BL/6J、C3H/HeJ、A/J型小鼠构建模型，研究结果证明C57BL/6J小鼠在结扎组中骨丢失最多，其次是C3H/HeJ和A/J；在组织学上，C57BL/6J小鼠的中性粒细胞和破骨细胞数量最多，且C57BL/6J小鼠表现出最活跃的骨重建。在种植体周围炎大鼠模型中常用的大鼠品系有SD、Wistar、Lewis等，其中SD大鼠与Wistar大鼠的应用较为广泛。

2.2 种植体设计

小鼠与大鼠在植入时需特制尺寸的种植体，小鼠微种植体的总长度一般为1.0～1.7 mm，直径一般为0.5～0.8 mm。大鼠微种植体的总长度一般为2.0～4.5 mm，直径一般为0.8～2.0 mm，目前尚无统一规格，研究者们多根据实验需要自行定制，主要包括圆柱形和锥形种植体，尺寸各异。

2.3 植入位点

在关于植入位点的研究中，大小鼠模型中以上颌第一磨牙作为植入位点较为普遍。在大鼠模型中，Shuto等[14]成功地在大鼠腭突建立种植体周围炎模型，但也有相关研究表明大鼠腭部种植的成功率低于38.4%，不宜作为种植研究的位点[15]，因此结合文献笔者认为在大小鼠模型中，上颌第一磨牙具备较多的骨量及较大的操作空间，是较为合适的植入部位。

2.4 建模方案

目前已有多种方法用于在啮齿类动物模型中诱导种植体周围炎，其中3种技术使用较广泛：结扎法、脂多糖注射法及灌喂法。本文就啮齿类动物种植体周围炎模型中所用的动物种类、造模干预的方式、拔牙至种植体植入时的时间间隔、种植体植入至开始干预的时间间隔、干预的时间周期进行归纳整理(表1)。并对目前的主流造模方法方式进行总结，归纳出目前啮齿类动物模型造模流程图(图1)。

表1 啮齿类动物种植体周围炎模型的建模方案Tab.1 Modeling scheme of peri-implantitis model in rodents

图1 啮齿类动物种植体周围炎模型的构建流程图Fig.1 Flow chart of peri-implantitis model construction in rodents

2.4.1 结扎法 研究表明无菌鼠仅有局部刺激因素时不会诱导种植体周围炎的发生；同样，普通环境的常规小鼠仅有微生物存在而无局部刺激的情况下，也不会诱导炎症的发生。因此，诱导种植体周围炎产生需要同时满足上述两个因素[37]。而利用结扎法在种植体周围进行丝线结扎可以打破种植体周围黏膜的密封状态，产生局部刺激性，同时促进了黏膜下细菌生物膜的形成，继而引发炎症性破坏。结扎法通常在种植体植入并愈合后进行，将5-0/6-0/7-0的丝线结扎在种植固定物头部，以诱导种植体周围炎的产生[23]。Nguyen Vo等[21]证明丝线结扎28 d可诱导炎症反应且伴随着明显的种植体周围骨吸收。也有研究报道丝线结扎14 d即可以诱导小鼠种植体周围炎的发生[25]，但是大多数学者仍然选择第28天作为一个成熟的结扎模型[21，32-33]。

2.4.2 脂多糖注射法 注射牙龈卟啉单胞菌来源的脂多糖不仅会导致种植体周围骨丢失，而且会导致种植体周围软组织的炎性变化[29]。利用脂多糖注射不需要等待菌斑的聚集及生长过程，加快疾病进程，一般在4周或6周即可建模完成。因此，它特别适合用于测试各种药物对炎症的治疗效果以及其他疾病因素对炎症的影响[35，38]。然而该模型的缺点是采用注射方式会对牙周组织造成一定的干扰，使用该模型时需要注意该方式本身带来的影响。

2.4.3 灌喂法 灌喂法是也是诱导炎症的一种方法，通过在体外培养外部病原体，如牙龈卟啉单胞菌、连翘坦纳氏菌等，并通过灌喂法将其引入大鼠或小鼠的口腔[39]。研究人员对小鼠灌喂6周后成功观察到口腔感染的发生[30-31]。与结扎及注射法相比，灌喂法所需要的时间相对增加，一般为6～12周。该技术的操作简便，技术难度较低，是可选择的方式之一。

2.4.4 其他构建方法 除了上述三种较为常见的诱导方法外，也有研究者提出多种诱导因素结合的联合致病法。有研究报道指出，将浸有牙龈卟啉单胞菌的结扎丝置于小鼠龈下可诱导牙周炎的产生[40]。此方法也被应用于种植体周围炎小鼠模型的构建，研究人员将浸有牙龈卟啉单胞菌的丝线结扎在种植体周围，2周后骨吸收显著增加，提示种植体周围炎的形成[28]。此外Freire等[41]在种植体植入大鼠口腔之前在钛植入物上建立了放线菌生物膜，并在植入后第7天和第6周依次观察到种植体周围黏膜炎和明显的种植体周围骨丧失，证明种植体周围炎的发生。其他辅助诱导炎症手段还包括高糖饮食，如Becker等[42]对小鼠种植体进行结扎后同时辅以高糖饮食成功诱导种植体周围炎的发生。李星佳等[43]也对大鼠种植体进行丝线结扎配合糖水喂养，2周后与对照组相比种植体周中性粒细胞与牙龈中的白细胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)显著增加且骨组织吸收明显，提示造模成功。

2.5 造模成功的检测方法

造模成功的检测指标主要包括临床观察、影像学和组织学三个方面。临床观察种植体周围炎组牙龈组织可见明显的红肿、质地变软和渗出并伴有上颌牙龈皱褶丢失或破裂的明显迹象。牙菌斑在种植体颈缘处积聚，且随着炎症进展，出现自发性出血和软组织增生[21]。由于种植体周围炎的主要特征是种植体周骨丢失，因此在影像学方面表现为种植体顶端至牙槽嵴顶距离显著增加，与炎症诱导前相比，骨水平显著下降[44]。在组织学评估方面，也可以观察到种植体周的骨水平明显降低，对破骨细胞进行测量和基因表达分析，破骨细胞的存在也证实了种植体周围出现了骨吸收[20]。同时在结缔组织中可以观察到大量中性粒细胞和巨噬细胞浸润，植入物周围组织的炎症前细胞因子白细胞介素-1α(interleukin-1α，IL-1α)和肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)的表达明显增加[21]。已知种植体周围炎会发生基质的降解和促炎细胞因子的转录，因此诱导处理后的组织显示出更多的基质金属蛋白酶-8(matrix metalloproteinase-8，MMP-8)和核因子κB(nuclear factor kappa B，NF-κB)染色，也提示种植体周围炎的存在[22]。

3 啮齿类种植体周围炎动物模型的应用

3.1 种植体周围炎相关分子机制研究

通过建立基因敲除小鼠模型，可以对炎症过程的相关分子、通路以及相互作用机制进行更深入的探索。有研究者利用Toll样受体4(toll-like receptor 4，TLR4)基因敲除小鼠验证了TLR4通过调节免疫B细胞的浸润、核因子κB受体激活剂配体/护骨素(receptor activator of nuclear factor kappa B ligand/osteoprotegerin，RANKL/OPG)的表达比值和不同炎症细胞因子的产生，介导结扎诱导的种植周炎小鼠的牙槽骨吸收[28]。Jung等[33]在结扎诱导种植体周围炎的大鼠模型上，进一步将含p65-转录调节域(transmembrane domain，TMD)连接的蛋白转导结构域(protein transduction domain，PTD)的溶液注射入腭部种植体周，证明P65-TMD-PTD抑制了NF-κB的功能，进而减少了大鼠种植体周围炎部位的炎症和骨吸收。Mori等[45]研究了在大鼠种植体周围上皮中的Scgba1、LPO和GBP2基因，这些特征性表达与发生种植体周围炎的风险相关。

3.2 种植体周围炎与牙周炎以及其他系统性全身疾病相关性的探讨

种植体周围炎与牙周炎的关系一直以来受到学者们的热议[46]。研究人员用啮齿类动物同时建立了牙周炎以及种植体周围炎模型，结果表明与牙周炎相比，种植体周围炎表现出更大的软硬组织破坏[22]、种植体周围炎对诱导因素去除后的恢复能力不如牙周炎[19]、抗原诱导的种植体周围组织破坏比牙周组织破坏发生得更快[47]。此外，牙周炎与全身系统性疾病的相关性已经得到了初步验证，种植体周围炎与全身性系统疾病是否相关？在临床上，已经证明高血糖患者种植体周围炎的发病率增高[48]，也有学者利用种植体周围炎动物模型研究口干症、糖尿病以及血糖波动等其他系统相关性疾病与种植体周围炎的相关性[20，32，35]。

3.3 种植体周围炎相关材料的应用研究

Washio等[49]采用细胞片技术在钛种植体周围形成了牙周样结构，提高种植体周围组织对感染的抵抗力；在研究新材料对种植效果的改善方面也有很多应用，例如在大鼠皮下放置或植入新型材料验证激光改良型种植体与传统种植体相比拥有更好的效果[50]、利用大鼠种植体周围炎模型验证包裹牙龈间充质干细胞(gingival tissue-derived mesenchymal stem cells，GMSCs)的黏附性水凝胶可以使发生种植体周围骨丢失的病态牙种植体周围形成完整的骨再生[51]、通过用纳米颗粒介导PPARγ基因可产生促进骨整合以及改善种植牙周炎的作用[52]。

4 啮齿类动物模型的局限性及展望

啮齿动物模型是探索感染引起的炎症性疾病发病机制背后分子机制的重要工具[39]。然而在现有的文献中，关于种植体周围炎动物模型的构建方法尚未统一，且有一定的局限性。首先由于结扎诱导技术产生的破坏是一种人为控制的侵入过程，结扎的类型、结扎的位置以及在菌斑形成期间更换结扎的频率均影响炎症的发生与发展，因此结扎诱导的组织破坏模型并不能作为概括种植体周围的发病机制的理想模型[53]。而脂多糖注射法的主要缺点在于它需要在口腔中进行多次注射操作且使用了免疫反应刺激物——脂多糖作为炎症的诱导剂，与种植体周围炎的自然发展过程有一定差距。最后灌喂法虽不需要对植入部位进行任何操作，但在实施过程中需要通过抗生素预处理和多次接种来抑制动物本身存在的内源性菌群，以促进人源性致病菌的定植，且当厌氧菌被引入口腔时必须在其不相容的龈上环境中定植和生存，对模型的构建造成一定挑战[54]。有研究表明将牙周炎患者的龈下菌斑经实验室处理后涂抹在小鼠牙齿的结扎丝上，可以成功诱导牙周炎，同时使人牙周炎相关细菌有效定植，且菌种更加丰富，更为接近于牙周炎患者口腔环境[55]。因此笔者认为将此方法应用在种植体上，从而实现动物模型菌群人源化是一种模拟人体种植体周围炎发展过程的有效方法。此外致病菌感染时选用多种菌群混合感染或许也可以更好地模拟人类口腔环境，缩小动物模型与临床研究的差异。除了造模方法本身的局限性，随着人群健康的变化，针对不同系统性疾病存在时的种植体周围炎的研究也对动物模型的构建提出更多要求，因此有必要探索更多存在相关系统性疾病的种植体周围炎模型。

5 总 结

综上所述，本文围绕啮齿类动物模型在种植体周围炎研究中的构建方法及应用展开介绍。种植体周围炎动物模型种类多，建模方案各异。虽然啮齿类动物模型具有实验周期较短、费用低、体型小、饲养较易以及相关基因操作及试剂易获得等其他动物模型不可取代的优势，但它的局限性也十分显著，如啮齿类动物微观和宏观结构、生长速度与人类存在差异，且体型的限制使实验对研究人员的操作要求较高。因此，研究者在进行相关实验时，仍需综合软硬条件，合理选择实验模型。总之，啮齿类动物种植周围炎模型为阐明促进种植周围炎进展的影响因素提供了有用的工具，而更好地理解种植体周围炎的发病机制则有望为新的治疗策略指明方向。