PIPS联合纳米银对根管粪肠球菌抗菌效果研究

崔静雯，范建林

微生物感染是导致根管治疗失败最直接的原因，其中粪肠球菌常为优势菌群[1]。现在临床上常使用的根管内消毒冲洗材料为次氯酸钠(NaClO)、过氧化氢、氯己定等，但这些材料已被证明其对粪肠球菌的抑制作用有限[2]。纳米银(silver nanoparticles，AgNPs)为新一代的广谱抗菌剂，且低浓度的AgNPs无细胞毒性，可作为根管冲洗液使用[3]。文献证明，AgNPs溶液(直径为10～100 nm)对G+和G-菌有较强的抗菌效果[4]。且AgNPs溶液可以破坏粪肠球菌生物膜结构，杀灭粪肠球菌[5-6]。Wu等[7]研究证实，粪肠球菌对AgNPs具有较强的耐药性，AgNPs溶液不能完全抑制粪肠球菌的生长。激光引发光声流系统(photon induced photoacoustic streaming，PIPS)是一种新型的激光活化冲洗技术，使用低脉冲能量产生快速和剧烈的光声冲击波，活化根管冲洗液并提高整个根管系统的冲洗效果，可以去除根管内更多的细菌和生物膜，显著提高冲洗液的抗菌和抑菌效果[8-10]。本研究选择AgNPs溶液作为根管内消毒冲洗材料，观察其单独或联合PIPS对体外根管内粪肠球菌的抗菌效果，并且比较其与临床常见根管冲洗材料NaClO的抗菌效果，旨在为临床根管消毒提供新型材料及方法。

1 材料与方法

1.1 样本收集和处理

本研究由苏州大学附属第二医院伦理委员会批准(SDFEYGJ2007)进行。收集2020—2021年因牙周病或正畸治疗等原因拔除的牙齿，选取其中36颗单根管离体牙。纳入标准为：牙冠完整(无龋坏或组织缺损)，牙根形态正常，根尖发育完全，经X线根尖片认定为单根管。将离体牙样本浸泡于0.9% NaCl溶液中保存备用。建立标准化模型，截去牙冠，仅保留距根尖孔16 mm长度的牙根。使用ProTaper机用镍钛锉依次预备根管至F3，并每次更换器械时，使用1 mL 5.25% NaClO冲洗根管。根管预备结束后，使用17% EDTA液，5 mL去离子水，1 mL 5.25% NaClO冲洗3 min，以便充分去除玷污层。使用无菌纱布干燥样本，在牙根表面涂布2层指甲油，防止其他微生物的感染。将样本置于1.5 mL脑心浸液(brainheart infusion，BHI)培养基，高温高压灭菌15 min后备用。

1.2 细菌培养

将粪肠球菌(ATCC29212,美国模式培养物集存库)从-80 ℃低温冰箱中取出，在超净工作台中解冻，并将其加入到已灭菌的BHI培养基中，37 ℃恒温培养箱中静置培养，调节菌液浓度至OD600 nm值为1.0(约1 × 109CFU/mL)。

1.3 感染根管模型的建立

将已消毒的样本分别置于无菌EP管中，随后抽取30 μL粪肠球菌菌液(1 × 109CFU/mL)，再将整个样本全部浸入BHI培养基中，放入厌氧盒中于37 ℃恒温培养箱培养4周，每隔48 h更换等量新鲜的BHI培养基[11]。

1.4 原始菌落计数

使用无菌纱布取出样本并吸干根管内的残余液体。3 mL 无菌生理盐水冲洗根管30 s，将#40吸潮纸尖伸入根管内30 s，然后将吸潮纸尖转移至含1 mL无菌PBS中，旋转30 s分散。梯度稀释，并取10 μL稀释液均匀涂布于BHI琼脂培养皿，37 ℃厌氧培养24 h。24 h后进行菌落形成单位(colony-forming units，CFU)的计数。

1.5 根管冲洗

将根管冲洗的方法分为两类：传统手动冲洗(conventional needle irrigation，CNI)和PIPS冲洗。传统冲洗是使用含3 mL根管冲洗液的30 G 侧方开口针头匀速冲洗根管2 min。PIPS冲洗是将激光尖置于髓腔中，激活 20 s，停留 10 s，重复 3 次，总共使用冲洗液 3 mL[12]。

本研究将感染后的模型随机分成6组(n=6)：①对照组(CNI)：0.9% NaCl + CNI; ②NaClO+CNI：2% NaClO+CNI;③AgNPs(AN)+CNI：0.1% AgNPs + CNI;④PIPS：0.9% NaCl+PIPS;⑤NaClO+PIPS:2% NaClO+PIPS；⑥AN+PIPS：0.1% AgNPs+PIPS。

1.6 处理后菌落计数

无菌条件下，3 mL无菌生理盐水冲洗根管30 s，使用#40 H锉预备至工作长度，#40吸潮纸尖放入根管内30 s。然后将H锉和吸潮纸尖转移至含1 mL无菌PBS中，旋转30 s分散。梯度稀释，并取10 μL稀释液均匀涂布于BHI琼脂培养皿，37 ℃厌氧培养24 h。24 h后进行菌落计数。

1.7 统计学分析

采用SPSS 25.0软件进行统计分析，对于服从正态分布的数据，使用平均值±标准差表示结果，并使用单因素方差分析(ANOVA)。比较各组CFU降低率(RCC)，RCC=(治疗前CFU计数-治疗后CFU计数)÷治疗前CFU计数×100%，当P<0.05时具有统计学差异。

2 结 果

药物处理及激光处理的根管内的粪肠球菌菌落数显著少于对照组(P<0.05)；PIPS+ 0.1% AgNPs、PIPS+ 2% NaClO组的根管内粪肠球菌菌落数显著低于PIPS组(P<0.05)；PIPS+ 0.1% AgNPs组的根管内粪肠球菌菌落数显著低于CNI+0.1% AgNPs组(P<0.05)；PIPS+2% NaClO组的根管内粪肠球菌菌落数显著低于CNI+ 2% NaClO组(P<0.05)；PIPS+0.1% AgNPs组的根管内粪肠球菌菌落数显著低于PIPS+2% NaClO组(P<0.05)(表1)。

表1 感染根管治疗前后粪肠球菌菌落数量分析Tab.1 Analysis of the number of E. faecalis colony-forming units before and after infected root canal treatment

3 讨 论

粪肠球菌是难治性根尖周炎最常见的细菌之一，其检出率为24%～77%[13]。粪肠球菌形成的生物膜具有较强的耐受力，是浮游菌耐药性的100～1 000倍，有利于其抵抗抗菌药物及吞噬作用等[14]。粪肠球菌的孵育时间直接决定了其结构和生物膜的耐药性[15]。粪肠球菌在孵育后的前1 h内主要处于浮游状态，然后开始形成生物膜；2周时，其对抗菌药物(如：1% NaClO，2%氯己定等)的敏感度较强；在3周后，对这些药物产生了高度的耐药性[16]。因此，本研究我们使用的模型为孵育4周的粪肠球菌。

目前，低浓度的AgNPs已被广泛应用于根管消毒药物。由于其尺寸较小，可以进入直径为2.4～2.9 μm的牙本质小管，抑制根管内细菌的生长[17]。AgNPs可直接渗透进入菌体内，通过与菌体内氧代谢酶中的巯基(—SH)结合，导致DNA分子变性，阻碍蛋白翻译，抑制细菌生长[18-20]。本研究发现0.1% AgNPs溶液使用传统冲洗器针头冲洗根管内粪肠球菌生物膜2 min，其生物膜菌落的降低率为36.62%，与使用2% NaClO传统方式冲洗根管的降低率(40.57%)无统计学意义。提示仅利用0.1% AgNPs或2% NaClO溶液短时间冲洗根管，并不能有效破坏粪肠球菌生物膜和抑制粪肠球菌生长。此研究结果与以往文献报道相符，由于AgNPs与细菌接触时间太短，无法有效渗透细菌生物膜，因而抗菌效果不佳[21]。

PIPS是一种新型的激光激活冲洗技术，将PIPS的工作尖置于根管的髓腔内，可迅速产生强大的冲击波，避免对根管壁和根周组织的热损伤，高效清理根管，使根管冲洗液到达根尖但不超出根尖孔，不损伤根尖周组织[22]。本研究中，仅使用0.9% NaCl冲洗根管并无明显抗菌效果。当使用PIPS辅助0.9% NaCl冲洗时，可发现粪肠球菌生物膜菌落降低率(41.34%)明显降低(P<0.05)，具有一定的抗菌效果。Trope[23]研究发现，PIPS可以使冲洗液产生强烈的对流和冲洗作用，从而导致细菌裂解死亡。Mohammadi等[24]研究证实，使用常规方法冲洗根管20 min，根管内消毒率达83%；但当使用PIPS辅助相同冲洗液冲洗根管1 min，根管内消毒率为100%。故PIPS与CNI相比，根管内细菌清除效率明显提高。本研究结果显示，使用PIPS辅助0.1% AgNPs或2% NaClO冲洗，根管内的粪肠球菌生物膜的降幅均大于使用CNI辅助0.1% AgNPs或2% NaClO组(P<0.05)，显著提高了根管冲洗液的抗菌效果。且PIPS辅助0.1% AgNPs冲洗根管内粪肠球菌生物膜的降幅(91.46%)明显大于PIPS辅助2% NaClO组(86.83%)。

综上所述，PIPS辅助0.1% AgNPs冲洗根管可以显著提高根管内粪肠球菌生物膜的清除效果，抑制粪肠球菌的生长，提高根管治疗的成功率。且PIPS辅助0.1% AgNPs冲洗根管可以减少AgNPs溶液溢出根尖孔，为根管冲洗临床实践提供了有效且安全的理论依据。