内皮细胞分泌的外泌体在缺血性脑卒中的研究进展

王敏,王鹏宇,王光明

(1.大理大学临床医学院,云南大理 671000;2.大理大学第一附属医院基因检测中心,云南大理 671000)

缺血性脑卒中是一种常见且严重的脑血管疾病,占所有脑卒中的87%,是持续性残疾的主要原因[1]。外泌体是常见的膜结合纳米泡,含有多种生物分子,如脂质、蛋白质和核酸。外泌体通过胞吐作用从细胞中衍生出来,被靶细胞摄入,并且可以在局部或远处细胞之间传递生物信号。外泌体分泌是一种组成性现象,参与生理和病理过程,并决定外泌体表面分子和内容物[2]。外泌体是一种内吞来源的纳米级细胞外脂质双分子层囊泡,在生理和病理条件下由几乎所有细胞类型分泌[2]。内皮祖细胞(endothelial progenitor cell,EPC)是一种特定类型的干细胞,在组织再生和修复中起作用[3]。内皮细胞来源的外泌体可以迁移到损伤区,在参与血管新生、恢复血脑屏障(blood brain barrier,BBB)的完整性、调节炎症反应、减轻脑卒中病理相关的运动和神经功能损伤等方面有重要作用[1]。静脉溶栓是急性缺血性脑卒中最有效的治疗手段之一,适用于症状发作后4.5 h内出现神经功能缺损症状的患者。随机试验表明,当症状发作后 4.5 h内接受静脉重组组织纤溶酶原激活剂(Ⅳ-rtPA)治疗时,更多患者恢复良好功能[4]。但治疗时间窗只有4.5 h,当Ⅳ-rtPA应用于卒中后4.5 h以上时,风险可能大于获益,而出血转化和氧化应激是主要的临床风险,这将进一步放大病理级联反应[5]。因此,对缺血性脑卒中的发病机制及治疗干预等进行深入研究显得尤为重要。卒中的病理生理过程受多种因素影响,其中炎症和血管生成在卒中的发病过程中起着重要作用[6]。作为一种替代全细胞植入的治疗策略,外泌体通过体液和循环将各种蛋白质和核酸传递给附近和远处的受体细胞,在细胞间通讯中发挥重要作用[7]。现就内皮细胞来源的外泌体在缺血性脑卒中的治疗进展作一阐述,然后讨论内皮细胞分泌的外泌体向缺血性脑卒中临床治疗转化的挑战。

1 外泌体的来源

在细胞通讯中作为媒介的外泌体,可以由哺乳动物的细胞分泌,在细胞间进行信息传送。邻近或远处细胞的行为可以被以旁分泌或内分泌方式从细胞释放的外泌体所修饰。此外,供体细胞还可以重新摄取自身分泌的外泌体[8]。在神经系统中,小胶质细胞、少突胶质细胞、星形胶质细胞、神经干细胞(neural stem cells,NSCs)等多种中枢神经系统细胞可分泌外泌体,调控神经系统疾病的发生发展[9]。

1.1 外泌体的生物学特征外泌体是由30～100 nm内体衍生的小膜性囊泡组成,生命系统中被细胞释放到细胞外液中。外泌体存在于人体体液中,如血液和脑脊液[10],具有功能性分子修饰的磷脂双分子层,富含蛋白质、脂质和核酸[2]。通过在源细胞和靶细胞之间重新分配其负载量,在细胞间通讯中起着至关重要的作用[10]。

1.2 外泌体的分泌和调节几乎所有的活细胞都能在不同的病理生理环境中分泌外泌体。小胶质细胞、少突胶质细胞、星形胶质细胞、NSCs 等多种中枢神经系统细胞可分泌外泌体,调控神经系统疾病的发生发展。这些中枢神经系统细胞来源的外泌体在促进血管生成、调节炎症和重塑卒中后大脑等方面发挥关键作用。此外,间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)因可分化为神经元而在脑卒中的治疗中受到广泛关注,但MSCs直径≥15 μm,使其难以在缺血区域靶向。但外泌体具有与其供体细胞相似的生理功能,因此,来源于中枢神经系统细胞和MSCs的外泌体被认为是一种潜在的治疗策略[1]。外泌体形成的第一步是细胞膜内陷,形成早期内体,早期内体的进一步内陷包裹细胞质中的蛋白质、脂质和核酸,形成腔内囊泡(intraluminal vesicles,ILVs)。运输所需的内体分选复合物(endosomal-sorting complex required for transport,ESCRT)家族参与调控外泌体的分子组成和ILVs的形成,如ESCRT-0、ESCRT-Ⅰ、ESCRT-Ⅱ负责货物的分拣,ESCRT-Ⅲ承担膜的变形和分裂[11]。随着ILVs的逐渐积累,早期内体成熟为晚期内体,部分多囊泡内体(multivesicular endosomes,MVEs)与细胞融合,通过胞吐作用分泌外泌体;另一部分MVEs被溶酶体降解,在这个过程中Rab GTP酶是一个关键的家族[12]。Rab27a和Rab27b专门在质膜上对接MVEs。Rab7调节MVEs与炎症溶酶体的2个中介体的融合来降解ILVs[13]。Rab31通过招募TBC1D2B到Rab7并进一步抑制MVEs与溶酶体的融合来抑制MVEs的降解[14]。

1.3 内皮细胞分泌的外泌体的特征内皮细胞来源的外泌体通过旁分泌机制刺激内源性内皮细胞的增殖和迁移,而不是直接分化为成熟的内皮细胞,从而促进内皮再生。作为旁分泌的关键成分,EPC来源的外泌体已被证实具有促进血管新生和改善功能恢复的作用[1]。EPCs对应于具有血管生成及其新特性的细胞群,因此它们可能在中风后BBB的重建中表现出独特的作用[15]。内皮细胞来源的外泌体在缺血性脑卒中临床治疗中的作用有进一步探讨的价值。

2 缺血性脑卒中发生及恢复时的病理生理变化

2.1 线粒体损伤线粒体损伤是缺血性脑卒中的主要标志之一。脑细胞(主要是神经元)中氧气和葡萄糖供应不足,会引发线粒体为主要特征的级联事件。线粒体钙超负荷、活性氧(reactive oxygen species,ROS)过量生产、线粒体通透性过渡孔(mitochondrial permeability transition pore,mPTP)开放和损伤相关分子模式(damage-associated molecular pattern,DAMP)的释放将线粒体置于一系列错综复杂的偶然相互作用的中心[16]。缺血性脑卒中后,线粒体功能的恢复有助于脑神经细胞的功能恢复,减少缺血区域的进展。

2.2 血脑屏障的破坏大脑是身体的免疫特权区域,通过BBB与身体的其他部分隔离。BBB是一种复杂的结构,由周细胞、内皮细胞和星形胶质细胞末端足组成,与紧密连接蛋白(如claudins和occludins)牢固地结合在一起,可以微调化合物在脑脉管系统中的流入和外排[17-18]。通过这种结构,神经血管单元星形胶质细胞能够与神经元活动一起调节血流,以匹配代谢需求。梗死后,在炎症细胞因子释放的驱动下,这种结构的完整性受到损害,导致溶质转运失调,外周免疫细胞的浸润。虽然这种免疫反应在缺血性脑卒中后的早期阶段可能是有益的,但长时间的BBB破坏和随后的神经炎症反应对修复过程是有害的[19]。在缺血性脑卒中发生后能够克服BBB的障碍至关重要。

2.3 炎症反应神经炎症反应是发生在缺血性脑卒中后的脑部急性病理过程。大脑发生炎症后会加剧受损脑组织和外周血中多种细胞因子的释放,这些细胞因子是中风诱导的免疫炎症反应中的重要介质。炎症介质可以促进受缺血影响的区域内许多炎症细胞型(诸如T细胞,单核细胞/巨噬细胞,嗜中性粒细胞和不同炎症细胞的各种亚型)的渗透;这个过程是造成大脑进一步缺血损伤的原因[6]。在缺血性脑卒中的早期控制炎症反应可以减少神经细胞的损伤,减少卒中后炎症的病理级联反应。

2.4 血管生成血管生成在内源性再生机制中具有良好的临床意义[20]。脑卒中后梗死周围微血管密度增加与缺血性脑卒中患者更长的生存时间有关,并可以改善缺血性动物模型的预后。这表明增强血管生成可能是促进缺血性脑卒中后功能恢复的策略之一。血管和神经元细胞通过各种介质相互交流,并作为一个整体参与脑缺血的病理生理过程。缺血性脑卒中后血管生成有利于中枢神经系统缺血半暗带脑血流的恢复,对缺血性脑卒中患者的恢复有良好的影响。如果在短时间内缺血半暗带血流恢复,则该区域脑组织的损伤是可逆的,神经细胞有可能存活并恢复功能[21]。

3 内皮细胞分泌的外泌体在缺血性脑卒中的作用机制

越来越多的证据表明,基于细胞治疗的积极效果是由外泌体介导的,这些外泌体来自接受治疗的细胞。此外,外泌体已被证明具有许多优点,例如,克服BBB的障碍,不阻塞血管,不诱导缺血后的缺血损伤[1]。

3.1 内皮细胞来源的外泌体在缺血性脑卒中炎症中的作用内皮细胞来源的外泌体可以迁移到损伤区,参与血管新生,恢复BBB的完整性,而且在调节炎症反应,减轻脑卒中病理相关的运动和神经功能损伤方面具有重要作用[22]。最近的研究发现EPC来源的外泌体可减少梗死面积,增加脑血流量(cerebral blood flow,CBF)和脑微血管密度(cerebral microvascular density,MVD),特别是富集miR-126的外泌体增强治疗效果[23],并发现富含miR-137的外泌体可对抗SH-SY5Y细胞的凋亡和线粒体功能障碍,其保护作用可能与环氧合酶2 (COX2 )/前列腺素E2(PGE2)信号通路有关,抑制COX2对抗炎起到有益作用[24]。

3.2 内皮细胞来源的外泌体在缺血性脑卒中神经保护和血管新生的作用缺血性脑卒中是由于脑部血管阻塞导致的神经功能丧失。内皮功能障碍和血管生成减少的组合加重了脑损伤。基于干细胞的治疗是缺血性脑卒中的一个有前景的治疗途径,通过其释放的生长因子和血管生成因子对血管及神经元单位具有保护作用[25]。EPCs具有巨大的潜力,因它们具有血管和神经元保护、修复和再生的能力。研究发现,在缺血性脑卒中后2小时对发生缺血性卒中的db/db小鼠通过尾静脉随机注射载体(PBS),内皮细胞分泌的外泌体(EPC-EXs)或内皮细胞分泌的富含miR-126的外泌体(EPC-EXsmiR126)。在第2天和第14天检测梗死体积、MVD、CBF、神经功能、血管新生和神经再生以及裂解的半胱天冬酶-3(cleaved caspase-3)、miR-126和血管内皮生长因子受体(vascular endothelial growth factor receptor,VEGFR2)水平。发现输注EPC-EXsmiR126比输注EPC-Exs更能有效保护脑卒中小鼠的CBF、MVD,也更能有效改善糖尿病脑卒中小鼠的神经功能[23]。

3.3 外泌体靶向治疗的意义治疗神经系统疾病的一个巨大挑战是血脑屏障,它只允许小于400道尔顿的脂溶性分子自发扩散。这可以防止约 98% 的药物、核酸和外泌体自发定位到大脑[26]。外泌体体积小,可有效避免单核巨噬细胞的吞噬作用,可自由穿过血管壁和细胞外基质。其表面表达CD55和CD59,避免了调理素和凝血因子的激活,因此可以在生物体液中广泛分布且稳定。与体外合成的脂质体等纳米递送系统相比,外泌体来源于机体,理论上具有更好的生物相容性和更低的免疫原性。外泌体具有很强的归巢靶组织或细胞的能力和穿透生物屏障(如血脑屏障)的能力[27]。这对于治疗缺血性脑卒中具有重要的意义。

4 内皮细胞外泌体在缺血性脑卒中的应用及展望

缺血性脑卒中仍然是世界范围内最严重的健康问题之一,缺血后炎症的发生以及线粒体损伤、细胞凋亡的演变在几分钟、几小时甚至几天内持续,尽快恢复损伤区域的血流、减少炎症反应的发生以及减少BBB的破坏,对于神经功能恢复和梗死面积的减少具有重要意义。目前现存的成熟的缺血性脑卒中的治疗方法包括静脉溶栓和血管内血栓的切除,但都有其局限性。内皮细胞分泌的外泌体通过调节血管生成和炎症效应以及克服BBB的障碍,在脑卒中治疗中发挥保护和修复作用。内皮细胞来源的外泌体作为新的细胞疗法,目前仍有许多问题需要探讨。外泌体分泌是一种组成性现象,参与生理和病理过程,决定于外泌体表面分子和内容物。在临床治疗中准确、高效、选择性地识别、分离和定量内皮细胞来源的外泌体至关重要。工程化的外泌体在药物负载和靶向改造两个方面取得进展,药物的负载可通过被动装载,如共孵育;主动装载,如超声、电转、透析、转染等方式来实现。靶向改造有生物连接法(通过能与外泌体铆钉的生物链接蛋白将想要负载在外泌体上的药物融合在一起,构建一个融合质粒,通过转染的方式,将质粒转染到细胞中)和化学连接法(外泌体膜亲和物质如胆固醇等双亲性的脂类物质与靶向肽连接,这样就可以将靶向肽连接在外泌体上)。也可通过末端修饰的方法来增加内皮细胞来源的外泌体在缺血性脑卒中的靶向性。细胞纳米穿孔方法可以制备含有治疗性miR-126、miR-137的外泌体。然而,这些方法可能会使内皮细胞来源的外泌体的表面分子结构、内容物等发生变化,导致治疗中不良反应的发生。深入地了解外泌体的分子特征,增加外泌体的分泌,改善内皮细胞来源的外泌体修饰策略、阻断外泌体在循环系统中被消除以及增加内皮细胞来源的外泌体在治疗中的靶向作用意义重大。未来有望用于改善缺血性脑卒中的临床治疗。

利益相关声明：所有作者均声明不存在利益冲突。