低温胁迫对葛叶片叶绿素及丙二醛含量的影响

杨小录 王一峰 何九军 孙 杰 陈 强 王永斌

（1 陇南师范高等专科学校 甘肃 成县 742500； 2 陇南特色农业生物资源研究开发中心 甘肃 成县 742500）

葛(Pueraria montana (Loureiro) Merrill)，又称野葛，葛根，是豆科植物葛属多年生藤本。块状根肥大，复叶，总状花序，荚果。葛在我国分布极广，除西藏等地外，均有分布[1]。葛有较高的经济价值，葛富含人体必需的矿质元素，叶片、茎有较多的蛋白质、粗纤维和异黄酮类化合物[2]，是很好的动物饲料和药材原料。葛根含有葛根素、总黄酮等，对血管有一定的扩张作用；葛花富含多种矿质元素和氨基酸；葛的茎纤维素含量很高，单纤维长度可达0.95 ~4.2 cm，是用途广泛的纤维植物。葛有较高的食用、药用、饲用以及生态等价值[3]，尤其是葛根黄酮在心脑血管、抗衰老、抗疲劳、抗氧化等方面有一定的功效[4]，其人工种植引起了人们的广泛关注。陇南有较大面积的人工种植葛，由于陇南春季3~5 月间易发生倒春寒，引发植物的冷冻害，对葛的生长也有一定的影响。本文通过对2 年生葛春季新展叶人工模拟低温胁迫，研究低温胁迫对葛的叶绿素、丙二醛(MDA)含量的影响，为葛的人工栽培提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料。试验用葛叶片来自陇南师范高等专科学校智能温室，为2 年生扦插苗。4 月底进行采集和试验。

1.2 试验方法。采集没有病虫害的葛叶片，将叶片上的灰尘、污渍用纱布拭去，装入食品自封袋中，分别置于常温(处理1，CK)、10 ℃(处理2)、5 ℃(处理3)、0 ℃(处理4)、-5 ℃(处理5)、-10 ℃(处理6)下处理，以常温处理为对照，每个处理设3 次重复，每1 组处理12 h，12 h 后进行指标测定。

1.3 指标测定

1.3.1 叶绿素及类胡萝卜素含量的测定。葛叶片用95%的乙醇充分研磨，用分光光度计分别在470 nm、645 nm、669 nm 波长下测定吸光值，并根据公式计算出叶绿素a、叶绿素b、类胡萝卜素的含量[5]。

1.3.2 丙二醛含量的测定。参考林艳[6]等的方法测定丙二醛含量。将葛叶片擦拭干净，精确称0.1 g，剪碎后放入研钵，加10%的TCA(三氯乙酸)2 ml，研磨成匀浆，继续加3 ml TCA 研磨，研磨液转入离心管，离心机4 000 r/min 离心10 min。取离心管中的上清液2 ml 至空白试管，加0.6%TBA(硫代巴比妥酸)2 ml，100 ℃水浴中恒温处理15 min，15 min 后取出，待试管冷却，测其在600 nm、532 nm、450 nm 波长的吸光值。计算公式：CMDA=6.45(A532-A600)-0.56A450；式中CMDA为丙二醛(MDA)含量，A600、A532、A450分别表示在600 nm、532 nm、450 nm 测得的吸光值。

1.4 数据处理。试验数据用SPSS 23 进行单因素方差分析，用EXCEL 软件作图。

2 结果与分析

2.1 低温对葛叶片叶绿素及类胡萝卜素含量的影响。由表1 看出，随胁迫温度的降低，葛春季新展叶的叶绿素、类胡萝卜素的含量整体变化不明显，但胁迫温度为-5 ℃时，叶绿素a、叶绿素b 以及叶绿素a + b的含量均达到最低值。叶绿素a、叶绿素b 以及叶绿素a+b、类胡萝卜素含量在胁迫温度范围内，与CK相比变化较小(P＞0.05)。由表2 可知，在低温处理下，叶绿素a、叶绿素b、叶绿素a+b 以及类胡萝卜素含量无差异(P＞0.05)。

表1 低温对葛叶片叶绿素及类胡萝卜素含量的影响

表2 低温对葛叶片叶绿素及类胡萝卜素含量影响的方差分析

2.2 低温对葛叶片丙二醛(MDA)含量的影响。丙二醛(MDA)是植物膜脂过氧化最重要的产物之一，在植物抗逆性研究中丙二醛的含量为常用指标，丙二醛含量的增加标志着膜损伤的加剧。从图1 看出，葛叶片MDA 含量在-10℃时达到最高值，是CK 的2.96 倍，说明在此温度下，膜损伤严重。胁迫温度范围在0℃~10℃时，MDA 含量变化不大(P＞0.05)，胁迫温度低于0 ℃时，MDA 含量与CK 相比，有差异(P＜0.05)，与孙佳平[7]等人研究结果相同。从表3 可以看出，在不同低温处理下，葛叶片中MDA 的含量有显著差异(P ＜0.01)。

表3 低温对葛叶片MDA 含量影响的方差分析

图1 低温对葛叶丙二醛(MDA) 含量的影响

2.3 低温对葛叶片形态的影响。从图2 可以看出，葛叶片经过低温胁迫后，形态上发生变化，其中0 ℃~10 ℃的胁迫对叶片形态的影响基本没有太大的差别，但是处理温度低于0℃时，葛叶片的叶色变化较大，叶片失去光泽度，叶色加深，叶片手感变软，有细胞失水的表现，与徐卫平[8]等研究结果相同。

图2 低温对葛叶片形态的影响

3 结论与讨论

3.1 叶绿素及类胡萝卜素在植物的光合作用过程中起着非常重要的作用，叶绿素a 和叶绿素b 共同组成光合原初反应天线色素和作用中心色素，类胡萝卜素是光合作用中的重要辅助色素，具有吸收、传递光能的作用[9]。叶绿素含量的高低与其光合作用的能力有一定的关联。在本试验中，随胁迫温度的降低，叶绿素和类胡萝卜素的含量整体呈下降趋势，表明其光合作用能力下降。王瑞霞[10]等研究低温对小麦的影响中发现，低温会引起小麦叶绿素含量的下降，导致光合速率、蒸腾速率以及气孔导度的下降。张瑶[11]等研究低温对黄瓜叶片光合作用的影响中发现，随温度的降低，叶绿素a、叶绿素b 及类胡萝卜素含量均有所下降，影响植物的光合作用。

3.2 低温条件下，植物体内的抗氧化系统平衡被打破，积累了较多的氧自由基和活性氧，氧自由基和活性氧攻击膜系统，对细胞膜系统造成伤害[12]，导致MDA 含量增加，MDA 含量的增加一定程度上反映了膜受伤害的程度，也能反映植物的抗寒能力[13]。MDA是一种过氧化产物，其值与植物抗逆性有负相关[7]。在试验中，随胁迫温度的降低，MDA 的含量逐渐增加，在-10℃时含量最高。

3.3 低温胁迫是常见的非生物胁迫之一，尤其是春季的倒春寒，对植物的危害更大。植物遭受低温胁迫时，其外部形态和细胞结构、生理生化等性质都会受到影响。在对甘蔗、番茄、水稻、小麦等作物的研究中发现，对低温胁迫应答的是miRNAS。在对拟南芥的研究中发现，miR397、miR408、393、168 等数十个miRNAS 表达了上调表达，表达量超过了1.5 倍[14]。miRNAS 通过抑制或者降解基因翻译，调控植物对低温的应答过程，其调控模式有多种[15]。

3.4 王达[16]等人研究认为，植物对低温的应对是非常复杂的过程，在植物体内有一系列的物质可以对低温逆境进行应激应答，这些物质主要有抗冻蛋白、脯氨酸、超氧化物歧化酶(SOD)等，这些物质共同作用来维持植物细胞渗透压、水势平衡，并通过氧化系统和抗氧化系统的平衡以降低或抑制细胞结冰，增加植物对低温的抵御能力。

综上，葛在低温的胁迫下，其叶绿素含量总体下降，MDA 含量上升。低温对植物的胁迫机理较为复杂，期待后期更深入的探究。