桃细菌性穿孔病的接种方法与不同品种抗性鉴定研究

董京萍，范若渝，王友德，杨丽娜，朱峰，纪兆林*

(1.江苏省扬州大学植物保护学院，江苏扬州 225009；2.江苏省扬州市仪征市陈集镇人民政府，江苏扬州 211408)

桃(Prunusperica)隶属蔷薇目(Rosales)蔷薇科(Rosaceae)李属(Prunus)，是中国十分重要的经济作物，因其独特的风味和丰富的营养，深受人们的喜爱。中国是世界上最大的桃生产国，同时也是世界上最大的桃消费国，年产量和消费量均达1 300多万t[1]。近几年，桃树上病虫害的发生率逐渐增加，目前常见的病虫害达到20多种[2]，其中桃细菌性穿孔病(peach bacterial shot hole)在各桃产区中均广泛发生，严重影响当年的坐果率和果实品质[3]。

桃细菌性穿孔病也被称为桃细菌性黑斑病(peach bacterial black spot)或桃细菌性斑点病(peach bacterial spot)，最早于1903年被Smith从北美的李(Prunussalicina)中发现[4]，病原为树生黄单胞李致病变种(Xanthomonasarboricolapv.pruni, Xap)，被欧盟植物检疫条例列为检疫对象。它的寄主主要是桃、李、杏和樱桃等李属植物[5]。Xap可以潜伏在桃树枝梢、腋芽和叶痕等组织中越冬，次年春季温度升高，越冬后的细菌开始繁殖，并在越冬部位进行初侵染形成病斑，病菌经雨水从病部溢出，随后借助风雨和昆虫传播到叶片、枝梢和果实上进行再侵染[6]。

为更加明确桃细菌性穿孔病的致病机理及防治方法，对桃树叶片、枝条和果实等部位开展室内接种实验。桃树离体叶片接种方法主要包括伤口法、注射法、喷雾法等，在实际应用中哪种方法更有效尚无定论。为此，笔者对几种常见的离体叶片接种方法进行比较，从而选出符合实验室条件下接种桃细菌性穿孔病菌的最适方法；并利用该方法，明确江苏省常见桃树品种对细菌性穿孔病的抗性，为果农选择桃树品种提供参考。

1 材料与方法

1.1 供试材料

供试菌株是从国内桃产区采集、分离、纯化、鉴定获得[7]，从中选择6个作为供试菌株。表1为6个供试Xap菌株的来源和菌株编号。

表1 桃细菌性穿孔病病菌分离株的来源与编号

供试桃品种：春雪和中桃9号(属早熟毛桃品种)、中油16号(属早熟油桃品种)、中油18号(属早熟黄肉油桃品种)、中桃5号(属中熟毛桃品种)、湖景蜜露(属中熟水蜜桃品种)、锦绣黄桃(属晚熟黄桃品种)。除湖景蜜露采集于本实验室温室盆栽桃苗，其他品种均采集于仪征市友德家庭农场桃园。

供试培养基：牛肉膏蛋白胨培养基(NB)，蔗糖10 g、酵母粉1 g、牛肉浸膏3 g，胰蛋白胨5 g，加入900 mL超纯水搅拌至完全溶解，用5 mol/L的NaOH调节pH值至6.8，最后定容至1 L，高温高压(121 ℃，110 kPa)灭菌备用；牛肉膏蛋白胨琼脂培养基(NA)是在1 L NB培养基中加入15 g琼脂后灭菌备用。

1.2 配置菌悬液

将上述菌株用接种针通过平板划线法于NA培养基上活化，取单菌落加入至NB培养基中，置于180 rpm、28 ℃的振荡培养箱中培养18 h，将菌液离心后弃上清，用无菌水将菌悬液浓度调为1×108cfu/mL[2]，以下试验均为该浓度[8]。

1.3 接种方法

取中油16号、中油18号、中桃5号、中桃9号、湖景蜜露、锦绣黄桃、春雪7个品种生长状况一致的桃叶片，于超净工作台中经75%酒精清洗1次、无菌水冲洗多次，无菌滤纸吸干水分备用。伤口接种法：用无菌注射器针头在处理过的叶片上轻戳一下制造伤口，随后在伤口处滴加20 μL菌悬液，待伤口表面菌悬液干燥；喷雾法接种：用无菌喷雾器喷洒60 μL菌悬液至叶片表面；剪叶法接种：用无菌剪刀蘸取适量菌悬液，于叶尖2～3 cm处剪下；注射法接种：用无菌注射器针头在处理过的叶片上轻戳一下制造伤口，用去掉针头的注射器轻抵住叶片正面，利用压力将20 μL菌悬液通过伤口注射到叶片中；浸泡接种法：将叶片置于菌悬液中浸泡5 min，随后用无菌滤纸吸去多余水分。用无菌水做上述相同的处理分别作为各自对照，处理后的叶片放于28 ℃恒温恒湿培养箱中培养，每天观察及统计发病情况。每种方法分别用6种菌株接种不同品种的叶片，每个品种各接种4张桃叶片，其中伤口接种法和喷雾法在每张叶片上沿主叶脉左右两侧对称位置处各有一个接种点，共8个生物学重复。

1.4 不同菌株的致病性测定

利用最适接种方法(注射法)将6种菌株分别接种到湖景蜜露相同数量、长势一致的离体叶片上，每张叶片选择3个部位接种菌悬液、1个部位接种等量无菌水，将接种后的叶片放入28 ℃恒温恒湿培养箱中培养，每天观察及统计发病情况。

1.5 不同桃树品种抗病性测定

选用致病性最强9-4号作为接种菌株，利用筛选出的最适接种方法(注射法)对所有品种的离体叶片分别进行接种，每张叶片均设置3个菌悬液接种点和1个无菌水接种点对照，将接种后的叶片放入28 ℃恒温恒湿培养箱中培养，每天观察及统计发病情况。

2 结果与分析

2.1 桃细菌性穿孔病叶片接种方法分析

6个菌株接种不同品种桃叶片的结果中，9-4菌株对湖景蜜露的病害症状最明显。接种的方法不同，叶片的发病情况也有所不同，表2为湖景蜜露不同接种方法的接种结果，接种10 d后发现仅伤口法、注射法和喷雾法接种的叶片上出现褐色水渍状病斑，属于典型的细菌性穿孔病症状。采用注射法接种点均发病，发病率达到100%，且发病症状最为明显；伤口法和喷雾法接种的发病率均为25%，但病斑较小，喷雾法接种产生的病斑不明显，易忽略。而常用的浸泡法和剪叶法的叶片一直未出现病斑。

表2 不同接种方法在湖景蜜露叶片的接种结果

2.2 桃细菌性穿孔病菌不同菌株的致病性分析

用6种菌株接种长势相同的离体叶片，采用注射法接种湖景蜜露桃叶品种。所有叶片上选择4个相同部位的点作为接种点，左上角的接种点注射无菌水作为对照，其他3个点接种菌株，每个菌株接种6张叶片，接种10 d后统计发病情况。结果显示，仅9-4、15b和25-3菌株接种的湖景蜜露叶片出现褐色水渍状病斑，而9-5、15a和35-6菌株接种的桃叶片上无明显变化(图1，图2)。菌株25-3和菌株9-4接种后产生的病斑较大，菌株25-3引起的病斑略小，菌株9-4、15b和25-3的发病率分别为83.3%、16.7%和5.6%，而菌株9-5，15a和35-6发病率为0(图1)。

图1 不同菌株接种湖景蜜露叶片的发病结果

图2 不同菌株对湖景蜜露离体桃叶片的发病情况

2.3 不同桃树品种对细菌性穿孔病菌的抗性分析

选用9-4菌株接种长势一致不同品种离体叶片，每张叶片选择3个接种点，每个品种接6叶片，接种10 d后观察表型(图3)。结果发现仅中油16号的叶片没有发病，其他品种的叶片上均有褐色水渍状斑点，其中6张湖景蜜露叶片上的18个接种点均出现细菌性穿孔病的典型病斑，发病率达到100%，为最敏感品种；中油18号和中桃9号的抗性也较低，其发病率分别达到83.3%和77.8%；锦绣黄桃的发病率是38.9%，抗性一般；中桃5号和春雪的抗性较高，发病率仅分别为16.7%和5.6%。

图3 9-4号菌株接种不同品种桃叶片的发病情况

3 小结与讨论

采用不同的接种处理法筛选室内最适接种方法，明确注射法接种是桃细菌性穿孔病离体桃叶片室内接种的最佳接种方法，该方法具有叶片发病率高、对照性强、易观察等特点。Smith[4]对桃细菌性穿孔病的早期发病叶片切片进行显微观察，发现病原体可以通过气孔进入叶片。Xap细菌增殖的第一个位点为体下腔，然后是海绵状薄壁组织，可能由于这些位点存在广阔的自由空间。随后，病原体在栅栏组织的细胞间隙中增殖[9]。注射法是直接将菌悬液注射入叶片组织液中，省去从气孔侵入的过程，使侵入效率更高、致病率更强。

利用注射法对叶片接种Xap的不同菌株，结果表明分离株间致病性存在明显差异，其中辽宁瓦房店的9-4菌株接种后叶片发病率最高，致病性最强，引起的症状最明显。不同产地的菌株具有较高的同源性，地理位置不同可能引起Xap菌株的遗传多样性[3]，菌株致病力也不同。用9-4菌株接种不同品种的桃离体叶片，早熟桃品种春雪和中油16号抗病性较强，早熟桃品种中油18号和中桃9号抗病性较差，中熟桃品种湖景蜜露抗病性较差，中熟桃品种中桃5号抗病性较强。研究结果表明，桃树品种的早熟晚熟特性与细菌性穿孔病的抗病性关联性不大。但是在选育抗性品种时，早熟的特性可以作为推广的一个重要因素[10]，鉴于选育各方面均佳的桃树抗性品种时期较长，因此可通过对菌株的抗病性强弱确定适合当地种植的桃树品种，如辽宁产区的果农可以优先选择春雪、中桃5号和中油16号。 而湖景蜜露、中油18号和中桃9号对桃细菌性穿孔病较敏感，应慎重选择。