野鸢尾黄素对人乳腺癌细胞MCF7增殖、迁移和侵袭的影响

2023-03-24 10:01毕彩云韩碧洁
海南医学 2023年5期
关键词:鸢尾黄素低剂量

毕彩云,韩碧洁

西安市北方医院妇科,陕西 西安 710000

乳腺癌是一种上皮性恶性肿瘤,已成为妇女身心健康的重大威胁[1-5]。目前,乳腺癌多通过手术、放疗、化疗、生物治疗、靶向治疗等方法治疗,但5 年总生存期仍较差[2-7]。因此,寻找新的治疗策略,提高临床患者的生存率尤为重要,中药治疗在肿瘤的治疗中有改善患者生存质量、延长患者生存期、降低转移复发率等优势,因此已成为乳腺癌重要的治疗手段。

野鸢尾黄素是一种O-甲基化异黄酮,具有雌激素、抗炎和抗肿瘤等生物活性[8-14]。它的抗肿瘤作用在乳腺癌中未见有报道,因此,本研究旨在探索野鸢尾黄素对人乳腺癌细胞MCF7的细胞增殖、迁移、侵袭能力的影响及其可能的机制。

1 材料与方法

1.1 材料 人乳腺癌细胞MCF7 购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库;FBS、RPMI-1640培养基、青链霉素、胰酶均购自Hyclone 公司;野鸢尾黄素购自美国MCE 公司;Transwell 小室购自美国Corning公司;β-catenin 抗体及p-GSK-3β-ser9 抗体购自美国Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 人乳腺癌细胞MCF7 采用RPMI-1640+10%FBS+1%青链霉素培养基于37℃恒温培养箱中培养,待细胞融合度达到80%~90%进行传代及实验。

1.2.2 CCK-8 实验检测细胞活力 实验设定为五组,取处于对数生长期,生长状态良好的MCF7细胞用RPMI-1640培养基调整细胞密度到5×103个/100 μL,以每孔100 μL细胞悬液加入96 孔板,37℃培养过夜;贴壁后加入不同浓度(0 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L、80 μmol/L、160 μmol/L)的野鸢尾黄素处理48 h[8],每空加入10 μL CCK-8 孵育30~60 min 并于酶标仪450 nm处测定其吸光度,计算不同处理组MCF7 细胞的细胞的增殖率。

1.2.3 细胞分组与给药方法 根据上述CCK-8实验结果,根据IC50(半抑制浓度)将实验分为对照组和低剂量组、高剂量组。空白对照组不加任何药物;低、高剂量实验组分别加入40 μmol/L和80 μmol/L 野鸢尾黄素处理48 h。

1.2.4 细胞侵袭 制备浓度为2×104/mL 的各组人乳腺癌细胞MCF7 无血清细胞悬液。24 孔板底部加800 μL RPMI-1640完全培养基,Transwell小室上室底部中央垂直加入100 μL 1 mg/mL 的Matrigel,待Matrigel干成胶状后在Transwell上室分别加入200 μL各组细胞悬液,5%CO2、37℃培养箱培养24 h。取出Transwell 小室,磷酸盐缓冲液(PBS)清洗一侧未侵袭细胞,并用10%甲醇溶液固定30 min。切下膜并在膜上滴1 滴5%结晶紫染液,静置染色20 min,PBS 清洗后于显微镜下观察拍照。实验重复3次。

1.2.5 细胞划痕实验 Marker笔在6孔板背后划线,将人乳腺癌细胞MCF7单细胞悬液,按每孔2×105个细胞均匀的接种到6 孔板中,5% CO2、37℃培养过夜。第二天用枪头比着直尺,尽量垂至于背后的横线划痕。然后用PBS清洗掉划下的细胞,加入无血清培养基、拍照。紧接着将培养板放入37℃、5%CO2培养箱,培养,24 h 后拍照,计算迁移距离。

1.2.6 免疫印迹实验检测β-catenin的表达 各组人乳腺癌MCF7 细胞经冰冻PBS 洗涤,在蛋白裂解缓冲液中提取,用Bradford法测定蛋白浓度后,变性并电泳分离。电泳后,蛋白质转移到PVDF膜并于4℃过夜孵育一抗β-catenin(1:200)及p-GSK-3β-ser9(1:150)。洗涤后,孵育二抗1 h,并用ECL化学发光系统观察信号,计算目的蛋白相对于GAPDH的表达量。

1.3 统计学方法 采用SPSS20.0 软件对各处理组进行统计分析。计量资料以均值±标准差(x-±s)表示,使用单因素方差分析(One-way ANVOA)对低剂量实验组、高剂量实验组及对照组侵袭、迁移、蛋白相对表达量等数据进行分析,不同处理间平均值的差异性显著性用Tukey's HSD test 分析。以P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 野鸢尾黄素对MCF7细胞活性的影响 CCK-8检测野鸢尾黄素处理的MCF7细胞活性,结果显示,野鸢尾黄素处理48 h后空白对照组及处理组(20 μmol/L、40 μmol/L、80 μmol/L、160 μmol/L)细胞活力分别为(100±4.00)%、(70.6±3.68)%、(62.9±2.60)%、(32.2±6.25)%、(19.8±6.58)%,与对照组比较,差异均有统计学意义(P<0.05),且具有浓度依赖性,如图1 所示。这提示野鸢尾黄素可抑制MCF7 细胞的增殖,基于野鸢尾黄素浓度为80 μmol/L 时,细胞的增殖能力为其半数,因此在后续的实验中采用40 μmol/L、80 μmol/L进行实验。

图1 CCK-8法检测MCF7细胞的活力Figure 1 MCF7 cell viability was detected by CCK-8

2.2 野鸢尾黄素对MCF7细胞侵袭的影响 Transwell实验结果显示,对照组、低剂量处理组和高剂量处理组侵袭的细胞数量分别为(130±3.33)个、(96±3.33)个和(66±2.66)个,与对照组比较,处理组细胞的侵袭能力均下降,且差异有统计学意义(P<0.001),与低剂量组比较,高剂量组细胞侵袭能力下降,差异有统计学意义(P<0.01),见图2。

图2 Transwell检测鸢尾黄素对MCF7细胞侵袭的影响Figure 2 Effect of tectorigenin on the invasion of MCF7 cells by Transwell invasion assay

2.3 野鸢尾黄素对MCF7细胞迁移的影响 细胞划痕结果显示对照组、低剂量组、高剂量组24 h 的迁移的距离分别为(392±7.32) μm、(272±17.45) μm 和(92±5.36)μm,与对照组比较,处理组细胞的迁移能力均下降,与低剂量组比较,高剂量组细胞迁移能力下降,差异均有统计学意义(P<0.01或P<0.001),见图3。

图3 细胞划痕检测野鸢尾黄素对细胞迁移能力的影响Figure 3 Cell migration was detected by cell scratch assay

2.4 野鸢尾黄素对MCF7 细胞β-catenin 蛋白及p-GSK-3β-ser9 的影响 Western Blotting 实验检测三组β-catenin 及p-GSK-3β-ser9 蛋白的表达,对照组、低剂量组、高剂量组β-catenin 蛋白相对于GAPDH的表达量分别为0.567±0.06、0.312±0.06 及0.243±0.05;p-GSK-3β-ser9 蛋白相对于GAPDH 的表达量分别为0.501±0.06、0.236±0.04、0.166±0.03。与对照组比较,低剂量及高剂量组细胞的β-catenin 及p-GSK-3β-ser9 蛋白表达均下降,与低剂量组比较,高剂量组细胞的β-catenin及p-GSK-3β-ser9蛋白表达均下降,差异均具有统计学意义(P<0.01 或P<0.001),见图4。

图4 WB检测野鸢尾黄素对MCF7细胞β-catenin及p-GSK-3β-ser9蛋白的影响Figure 4 Effect of tectorigenin on β-catenin and p-GSK-3β-ser9 of MCF7 cells was detected by western blot

3 讨论

乳腺癌是对女性健康和生命威胁最大的恶性肿瘤之一,虽然手术、放疗、化疗等传统的治疗策略在一定程度上提高了乳腺癌患者早期的总生存率,但是肿瘤的耐药、复发、侵袭、转移、抗辐射等恶性表型特征使其致死率居高不下[1-5]。

植物雌激素是一类从植物中提取的多酚类化合物,其结构与内源性雌激素相似,已被证实具有多种生物活性。其以长期使用的安全性和可忽略/不存在副作用为特点,被认为是传统化疗的佐剂,亦被证明可以对抑制多种癌症的生长、侵袭和转移[15-17]。野鸢尾黄素是一种植物雌激素,具有抗炎、抗肿瘤的特性,如Yang 等[18]研究结果表明紫葛根花中提取的一种异黄酮类化合物野鸢尾黄素增强了紫杉醇对MPSC1(TR)、A2780(TR)和SKOV3(TR)等紫杉醇耐药卵巢癌细胞的生长抑制作用。研究结果表明,以野鸢尾黄素为主要活性成分的葛根提取物对卵巢癌细胞具有较高雌激素生物效价和较强的细胞毒性作用[19-20]。另外,野鸢尾黄素可抑制激素反应性前列腺癌细胞的增殖,导致G1 期阻滞中p21 (WAF1)或p27kip1 蛋 白 表 达,并 下 调PDEF、PSA、hTERT 和IGF-1 受体基因表达[21-22]。这些研究结果提示植物雌激素野鸢尾黄素在激素应答性乳腺癌中可能有一定的作用。因此,本研究检测了野鸢尾黄素对人乳腺癌MCF7 细胞的作用,结果显示随着野鸢尾黄素浓度依赖性的抑制MCF7细胞的增殖。

肿瘤细胞的增殖、迁移与侵袭是肿瘤的重要特征,同时也是导致肿瘤致死率高的重要原因,本研究细胞划痕及Transwell 实验结果显示40 μmol/L 及80 μmol/L 的野鸢尾黄素可显著抑制MCF7 细胞的侵袭及迁移。另外,多项研究表明Wnt/β-Catenin信号通路在肿瘤的侵袭迁移等重要进程中发挥不可或缺的调控作用,β-Catenin 作为Wnt/β-Catenin 信号通路的核心分子[15-17],其表达水平与乳腺癌患者的预后呈负相关,其表达越高,表明预后越差。GSK3β是Wnt/β-catenin 信号通路的负调控因子,位于β-catenin 的上游,抑制β-catenin的过度激活,而GSK-3β-Ser9磷酸化时,β-catenin 受到保护,从而在细胞质中逐渐积累[23]。本研究检测了野鸢尾黄素处理的MCF7细胞β-catenin及p-GSK-3β-Ser9 的表达水平,结果表明,野鸢尾黄素可抑制β-catenin及p-GSK-3β-Ser9的表达,即野鸢尾黄素可能通过调节p-GSK-3β-Ser9 的表达从而抑制β-Catenin蛋白的表达。

总之,野鸢尾黄素可能通过调节Wnt/GSK-3β/β-catenin 通路从而抑制MCF7 细胞的增殖、侵袭和迁移,为野鸢尾黄素在乳腺癌中的应用提供了理论支持。

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