生物信息学分析TLCD1 在肝细胞肝癌中的表达及意义

刘宁

（常州市妇幼保健院消化科，江苏 常州 213000）

目前，肝细胞肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）已经成为全球第6 大最常见的肿瘤，其高发病率和高死亡率严重危害了人们的健康[1]。HCC 的治疗方式主要包括手术切除、动脉化疗栓塞、射频消融、化疗、免疫治疗等。然而，药物耐药、肿瘤复发等导致治疗失败仍然很常见[2-4]。因此，探索新的治疗靶点对肝细胞肝癌的治疗有重要意义。TLCD1 位于细胞膜上，参与细胞膜组装、磷脂稳态、调节膜脂分布等多种生物进程[5]。细胞膜成分和流动性的改变与肿瘤细胞的生长和转移有关[6]。研究发现[7]，TLCD1在葡萄膜黑色素瘤中表达显著异常，并且其异常表达与患者无远处转移生存预后存在相关性。可见，TLCD1 可能在肿瘤发生发展中有重要作用。关于TLCD1 在HCC 中的作用仍未有相关研究报道。本研究通过生物信息学分析，研究TLCD1 在HCC 中的mRNA 表达情况，以及在患者预后预测中的价值，并探讨其潜在的作用机制，为HCC 的治疗带来新的思路。

1 数据来源与方法

1.1 TIMER2.0 数据库 TIMER2.0 数据库（http://timer.comp-genomics.org）用于分析来自TCGA 数据库中不同肿瘤组织的基因表达情况和免疫细胞浸润水平。通过TIMER2.0 数据库“Gene_DE”模块，研究TLCD1 在30 余种肿瘤组织和正常组织中mRNA的表达差异。

1.2 GEPIA 数据库 GEPIA 数据库（http://gepia.cancer-pku.cn/）是一个具备基因表达差异分析、相关性分析、预后分析等多种功能的综合性基因分析平台。本研究通过GEPIA 分析TLCD1mRNA 在HCC 与正常组织中的表达差异，结果以箱式图展示。利用“Survival:Survival Plots”模块分析TLCD1mRNA 的表达差异对HCC 患者预后的影响，主要包括患者的总生存期（OS）和无病生存期（DFS）。

1.3 UALCAN 数据库 UALCAN 数据库（http：//UALCAN.path.uab.edu/）用于深入分析TCGA 数据库中31 中肿瘤的基因表达数据。本研究通过该数据库进一步验证TLCD1mRNA 在HCC 组织和正常组织的表达差异，并且分析在HCC 患者不同种族、分期、分级等亚组间TLCD1mRNA 的表达差异。

1.4 Kaplan-Meier Plotter 数据库 Kaplan-Meier Plot ter 数据库（http：//www.kmplot.com）用于分析来自21种肿瘤类型的25 000 多个样本中，超过30 000 个基因的表达和生存之间的相关性。采用该数据库研究TLCD1mRNA 表达情况与HCC 患者预后的关系，TLCD1 高表达与低表达按最佳临界值划分，绘制OS、无复发生存期（RFS）、无进展生存期（PFS）、疾病特异性生存期（DSS）生存曲线。

1.5 LinkedOmics 数据库 LinkedOmics 数据库（http://linkedomics.org/）可用于分析多种癌症的多组学分析[8]。通过该数据库的“LinkFinder”模块，筛选获得与TLCD1 共表达基因，以火山图形式呈现，相关性采用Pearson 相关系数检验。功能富集分析通过“LinkInterpreter”模块，通过GSEA 进行KEGG 通路分析，参数设置为1000 次模拟，P＜0.05。

1.6 统计学方法 采用t检验分析HCC 组织和正常组织中TLCD1mRNA 表达差异；单因素方差分析比较不同HCC 亚组间TLCD1 的表达情况。通过Kaplan-Meier 曲线和Log-rank 检验进行TLCD1 的生存分析，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 TLCD1mRNA 在不同肿瘤组织中的表达情况TIMER2.0 数据库分析结果显示，TLCD1mRNA 在HCC、结肠癌、直肠腺癌、胆管癌、食管癌、胃癌、胰腺癌、肺腺癌、肺鳞状细胞癌、膀胱移行细胞癌、前列腺癌、肾乳头状细胞癌、乳腺浸润癌、宫颈鳞状细胞癌和宫颈内腺癌、子宫内膜癌、多形性成胶质细胞瘤、头颈部鳞状细胞癌、甲状腺癌中，较相应正常组织，表达显著上调，而在在肾嫌色细胞癌、肾透明细胞癌中表达下降（P＜0.05），见图1。

图1 TIMER2.0 数据库中TLCD1mRNA 在不同肿瘤组织中的表达水平

2.2 TLCD1mRNA 在HCC 中表达情况 本研究通过GEPIA 数据库，对369 例HCC 组织和160 例正常肝组织的TLCD1mRNA 表达情况进行分析，结果提示，TLCD1mRNA 在HCC 中表达显著提高，差异有统计学意义（P＜0.001），见图2A。在UALCAN 数据库中，对两组间的表达差异进一步验证，结果显示TLCD1mRNA 在HCC 组织中显著高表达（P＜0.001），见图2B。

图2 TLCD1mRNA 在HCC 组织和正常组织中的表达水平

2.3 TLCD1mRNA 与HCC 临床病理参数的关系 采用UALCAN 数据库，探讨了TLCD1mRNA 与HCC临床病理参数的关系。TLCD1 的表达与性别、年龄无相关性（P＞0.05），见图3A 及3B。而TLCD1mRNA在亚洲HCC 患者组织中，表达情况高于白种人及非裔美籍，差异有统计学意义（P＜0.05），见图3C。随着肝癌分期、病理分级的增加，TLCD1mRNA 表达也呈上升趋势，即Ⅱ期或Ⅲ期HCC 患者中，TLCD1mRNA的表达水平较Ⅰ期患者升高，差异有统计学意义（P＜0.05），图3D；在低分化或未分化的肝细胞肝组织中，TLCD1mRNA 的表达水平也均高于高分化或中分化者，差异有统计学意义（P＜0.05），见图3E。此外，TLCD1mRNA 的表达与TP53 突变情况有关，在TP53 突变的HCC 中，TLCD1mRNA 的表达水平也显著升高，见图3F。

图3 GEPIA 数据库中TLCD1mRNA 在不同HCC 亚组间的表达情况

2.4 TLCD1 表达与HCC 患者预后的相关性 为了进一步探讨TLCD1mRNA 表达水平对HCC 患者预后的影响，本研究分析了Kaplan-Meier Plotter 线上数据库中364 位HCC 患者的预后数据。结果发现，在HCC 患者中，高表达TLCD1 组较低表达组预后差（OS：HR=1.49,95%CI：1.05～2.11，P=0.024；PFS：HR=1.48,95%CI：1.1～1.98，P=0.0094；RFS：HR=1.49,95%CI：1.07～2.08，P=0.018；DSS：HR=1.67,95%CI：1.06～2.62，P=0.025），见图4A～4D。同时，通过GEPIA 数据验证TLCD1 在HCC 患者预后的预测价值，结果也提示，TLCD1 高表达的患者OS 和DFS 明显低于低表达的患者（OS：HR=1.7，P=0.0035；DFS：HR=1.7，P=0.000 57），见图4E 和4F。

图4 TLCD1 表达水平与HCC 患者预后的关系

2.5 TLCD1 在HCC 中的共表达及相关通路的富集分析 利用LinkedOmics 数据库对在HCC 中TLCD1的共表达基因进行分析，结果显示，共有5402 个基因与TLCD1 表达呈正相关（P＜0.05），6519 个基因与TLCD1 表达呈负相关（P＜0.05），见图5A。与TLCD1表达正相关性最强的基因为SAC3D1，相关系数为0.657；与TLCD1 负相关最强的基因为HERC3，相关系数为-0.624。KEEG 通路富集分析表明，TLCD1 可能与核糖体、氧化磷酸化、剪切体、蛋白酶体、RNA转运、嘌呤代谢等信号通路相关，见图5B。

图5 在HCC 中TLCD1 的共表达基因（LinkedOmics 数据库）

3 讨论

近年来，生物信息学为医学的发展开辟了新的途径，特别是在探索肿瘤治疗新靶点中发挥重要作用[9]。目前，分子靶向药物仍然是中晚期HCC 患者的主流治疗措施，索拉菲尼、瑞格菲尼等分子靶向药物现已广泛运用于临床，但药物耐药导致治疗失败仍然很常见[10，11]。因此，寻求新的治疗靶点，对改善HCC 患者预后有重要意义。

目前，关于TLCD1 在肿瘤中的作用的研究仍较少。近年来发现，TLCD1 可以通过抑制多不饱和脂肪酸进入膜磷脂，进而调节质膜的流动性[5]。膜流动性的增加，可以导致肿瘤侵袭性增加和肿瘤进展[12]。而调整细胞膜的组成和流动性，是治疗HCC 的有效手段[12-14]。因此，可以推测TLCD1 可能在HCC 发生发展中有重要作用，可能是HCC 治疗的潜在作用靶点。

通过检索GEPIA 和UALCAN 数据库，发现TLCD1mRNA 表达在HCC 组织中，相较于正常肝组织显著升高，且随着HCC 临床分期和病理分级的升高，TLCD1mRNA 表达呈上升趋势。可见TLCD1mRNA 的表达水平可能成为HCC 诊断、临床分期和病理分级评估的参考指标。TP53 基因突变诱发了HCC 的发生发展[15]。本研究还发现，在TP53 突变的HCC 组织中，TLCD1mRNA 呈现高表达，提示TLCD1 与TP53 基因突变存在相关性，从而参与了HCC 的进程。

Kaplan-Meier Plotter 数据库和GEPIA 数据库分析发现，TLCD1mRNA 高表达的HCC 患者OS、RFS、PFS、DSS 和DFS 均显著低于低表达的患者，即TLCD1mRNA 可能作为预测HCC 预后的潜在标志物。

本研究采用LinkedOmics 数据库，进一步探讨TLCD1 在HCC 中的作用机制。SAC3D1 是与TLCD1正相关性最强的基因，研究表明，SAC3D1 参与了中心体复制、纺锤体组装等细胞周期进程[16]，且SAC3D1 过表达是HCC 预后不良的潜在标志[17，18]。基因富集分析提示，TLCD1 共表达基因参与核糖体、蛋白酶体、RNA 剪切、转运、氧化磷酸化等信号通路，这些通路与基因表达调控、能量代谢的诸多过程密切相关。基因突变在HCC 中尤为常见，关键基因的突变可诱发HCC 的发生发展[19，20]。TLCD1 与抑癌基因TP53 突变有相关性，可以推断具有基因表达调控作用的TLCD1 可能参与了TP53 的突变，在HCC 形成发展中起关键作用。TLCD1 在HCC 中具体作用机制仍待更多研究验证。

综上所述，本研究基于公开的基因表达和临床数据库，对TLCD1mRNA 在HCC 中的表达情况及预后价值进行探索，发现TLCD1 在HCC 中的上调可能对基因表达调控的多个环节有深远影响，有望成为HCC 新的预后生物标志物和治疗靶点。