刺梨提取物抗炎活性及对溃疡性结肠炎小鼠的治疗作用

王 丽 李立郎 李齐激 王 瑜 杨小生

(1.省部共建药用植物功效与利用国家重点实验室，贵州 贵阳 550014；2.贵州省中国科学院天然产物化学重点实验室，贵州 贵阳 550014)

溃疡性结肠炎(ulcerative colitis，UC)是一种常见的原因不明的慢性结肠炎症，为消化内科常见病，临床上主要以腹痛、腹泻、黏液脓血便为特征，反复发作，严重影响患者身心健康。近年来，UC 在全球的患病率呈持续上升的趋势，发病高峰在20～40岁，老年人是另一个发病高峰，但稍低于青年人群，世界范围内的UC患病率估计在5～500人/10万人[1]。目前治疗UC主要以5-氨基水杨酸类药物、糖皮质激素和免疫抑制剂为主，这些药物普遍存在副作用大、复发率高且价格昂贵等特点[2]。研究[3]发现，用中药治疗UC不仅能够长期缓解症状，还可以减少复发，且疗效显著，能明显提高患者的生活质量。

刺梨为蔷薇科蔷薇属植物刺梨RosaroxburghiiTratt.(Cili)的果实，主要分布于中国贵州、云南、湖南等省份，尤其在贵州省呈大规模人工种植。《中华本草》[4]中记载刺梨具有健胃、消食、止泻之功效，主治食积饱胀、肠炎腹泻。刺梨富含维生素C、超氧化歧化酶(SOD)、多糖及三萜类化合物等多种活性成分，针对刺梨的药理活性，目前有抗氧化、抗癌、防治糖尿病、抗动脉粥样硬化等药理作用的研究报道[5-6]，尚未见关于刺梨的抗炎活性及对溃疡性结肠炎的治疗作用的研究报道。

Keap1-Nrf2-ARE信号通路是细胞防御氧化应激损伤的最重要机制之一，与氧化应激相关的多种疾病(如炎症、神经退行性疾病、癌症、心血管系统疾病和代谢等疾病)都有相关性，已成为这些疾病预防和治疗的靶点[7-8]。研究拟采用RAW264.7小鼠巨噬细胞炎症模型评价刺梨提取物的体外抗炎活性，将刺梨提取物作用于UC小鼠，观察其治疗效果，并初步探讨其药理作用机制，为UC的临床治疗方案提供试验依据，阐释刺梨的健脾、止泻功效，明确其治疗肠炎腹泻的作用。

1 材料与方法

1.1 试验动物

KM小鼠：清洁级，体重(20±2)g，雌雄各半，辽宁长生生物技术股份有限公司。

1.2 药品与试剂

RAW264.7细胞：功能天然产物与产品开发中心细胞库；

葡聚糖硫酸钠：分析纯，美国MP公司；

地塞米松、脂多糖：分析纯，美国Sigma公司；

DMEM培养基、胰酶、胎牛血清、双抗：美国GIBCO公司；

NO试剂盒、BCA蛋白定量试剂盒、β-actin抗体：上海碧云天生物技术有限公司；

Nrf2单克隆抗体、Keap1单克隆抗体：英国Abcam公司。

1.3 主要设备

CO2恒温培养箱：CCL-240B-8型，新加坡艺思高科技有限公司；

倒置荧光显微镜：TS2 FL型，尼康映像仪器销售(中国)有限公司；

细胞计数仪：Countess Ⅱ型，赛默飞世尔科技(中国)有限公司；

酶标仪：VICTOR Nivo型，美国PerkinElmer公司；

电泳仪：1645050型，美国BIO-RAD公司；

蛋白成像系统：ChemiScope 3000mini型，上海勤翔科学仪器有限公司。

1.4 试验方法

1.4.1 刺梨提取物的制备 刺梨鲜果于55 ℃烘干，粉碎，过二号筛，按料液比1∶15(g/mL)加入体积分数70%的乙醇溶液，提取2次，每次提取2 h，合并提取液，过滤，滤液回收乙醇，浓缩至适量，加入10倍量的双蒸水，回流2次，每次回流1 h，弃去滤液，滤渣真空干燥(滤渣厚度为6 mm，置于-80 ℃预冻过夜，绝对压强为20 Pa、隔板温度40 ℃、冷阱温度-60 ℃)成粉末，即为刺梨提取物。

1.4.2 MTT法检测刺梨提取物对RAW264.7细胞活力的影响 根据文献[8-9]，将对数生长期且状态良好的小鼠单核巨噬细胞RAW264.7以3×104mL-1的密度制成细胞混悬液并接种于96孔板中，每孔加入90 μL细胞混悬液，放于(37 ℃，5% CO2)细胞培养箱中培养18 h。给药组给予不同浓度的刺梨提取物溶液，每孔10 μL，空白组加入同体积的培养基，每组浓度设置5个复孔。继续培养18 h，每孔加入20 μL MTT(5 mg/mL)。置于培养箱内培养4 h后，将上清液吸出，每孔加入160 μL DMSO溶解甲臜沉淀，避光条件下振摇10 min使甲臜完全溶解后置于酶标仪490 nm下检测每个孔的OD值。重复试验3次。按式(1)计算细胞活力：

(1)

式中：

Cv——细胞活力，%；

A1——给药组的吸光度值；

A2——对照组的吸光度值。

1.4.3 刺梨提取物对RAW264.7细胞释放NO的影响

根据文献[10-11]，将对数生长期且状态良好的小鼠单核巨噬细胞RAW264.7以2×105mL-1的密度制成细胞混悬液并接种于96孔板中，每孔加入80 μL细胞混悬液，放于(37 ℃，5% CO2)细胞培养箱中培养18 h。每孔加入10 μL含有不同浓度的刺梨提取物或者Dex溶液，LPS组及空白对照组均加入等体积的培养液，每个浓度设置3个复孔。1 h后每孔加入10 μL LPS(终质量浓度为1 μg/mL)，空白组加入等体积的培养液，继续培养18 h后，按试剂盒说明书收集细胞上清采用Griess法进行NO含量测定。

1.4.4 刺梨提取物对UC的影响 小鼠50只适应性喂养1周后，随机分为5组，分别为空白组、模型组、刺梨提取物低、中、高剂量组(50，100，200 mg/kg)。空白组饮用蒸馏水除外，其余各组试验小鼠自由饮用3% DSS溶液7 d，以诱导试验性UC模型。试验期间仔细观察记录小鼠的一般状态、大便性状及隐血情况，并对各组小鼠进行疾病活动指数(DAI)评分，评分标准[12-13]见表1，按式(2)计算出各组小鼠的DAI得分情况。

表1 DAI 评分标准表†

DAI=S1+S2+S3，

(2)

式中：

DAI——疾病活动指数；

S1——小鼠体重下降评分；

S2——小鼠大便性状评分；

S3——小鼠大便隐血评分。

试验第8天脱颈椎处死小鼠，分离出小鼠脾脏并称重，游离并截取全段结肠，去除肠内容物，冰冷生理盐水漂洗，滤纸轻轻吸干后称湿重，测量结肠长度。距肛门2 cm 处剪取1 cm长结肠组织样本，采用福尔马林溶液进行固定，石蜡包埋，切片，HE染色，并采用免疫组化检测结肠组织中Nrf2及Keap1蛋白的表达。剩余结肠置于-80 ℃冰箱中保存，用来进行Western blot试验。

1.4.5 Western blot检测结肠组织中Keap1及Nrf2的表达 剪取小鼠结肠组织约80 mg，用生理盐水冲洗，滤纸吸干水分后剪碎并加入RIPA裂解液500 μL，匀浆机研磨提取蛋白，经BCA定量蛋白浓度后，电泳，蛋白转印至PVDF膜上，TBST 洗涤3遍，每遍10 min，5%脱脂牛奶中室温封闭1 h，Keap1及Nrf2抗体(1∶500)4 ℃孵育过夜，TBST洗涤3遍，每遍10 min，加入二抗(1∶30 000)室温孵育2 h，TBST洗涤3遍，每遍10 min，滴加ECL后避光进行化学曝光，显影并扫描分析，对目的条带做灰度分析，以目的蛋白的灰度值比内参β-actin 的灰度值校正误差，比较蛋白表达情况[9-10]。

2 结果与分析

2.1 刺梨提取物对RAW264.7细胞活力的影响

如图1所示，刺梨提取物质量浓度达到20 μg/mL时表现出了细胞毒性(P<0.05)，当质量浓度≤10 μg/mL时对细胞存活率无显著影响(P>0.05)。因此，在后续的细胞试验中选用刺梨提取物的最高质量浓度为10 μg/mL。

与空白组相比，* P<0.05

2.2 刺梨提取物对RAW264.7细胞NO释放的影响

不同质量浓度的刺梨提取物(2.5～10.0 μg/mL)和LPS(1.0 μg/mL)共同作用于RAW264.7细胞18 h 后，采用Griess法检测细胞培养液上清中NO的含量。结果如图2所示，空白对照组的NO含量微少，LPS组用LPS处理后NO含量较空白组显著增加(P<0.001)，表明造模成功，阳性对照药Dex显著降低NO的释放(P<0.001)。

与空白组相比，### P<0.001；与模型组相比，* P<0.05，** P<0.01，*** P<0.001

不同浓度刺梨提取物可不同程度地逆转由LPS诱导的NO释放量增加，且呈剂量依赖关系。

2.3 对试验性小鼠UC的影响

2.3.1 一般状态观察及DAI评分 空白对照组小鼠在整个试验过程中均保持精神状态良好，日常进食量正常，毛发光泽，活跃，大便正常。模型组小鼠日常进食量减少，明显消瘦，出现拱背、活动减少、大便性状改变等现象，造模第3天开始大部分小鼠出现不同程度的黏液便或血便等大便异常现象，DAI评分逐日增高，于第3天起显著高于空白对照组。刺梨提取物各组小鼠一般状态良好，大便异常情况出现晚于模型组，刺梨提取物100 mg/kg组在第3，5，7天的DIA评分明显低于模型组，刺梨提取物200 mg/kg组在第5，7天的DIA评分明显低于模型组，结果见表2。

表2 刺梨提取物对试验性UC小鼠DIA评分和体重的影响†

2.3.2 小鼠体重、结肠长度、结肠湿重指数及脾脏重量的测定 小鼠摄入DSS后会导致其免疫力下降、结肠出现水肿等情况，具体表现为小鼠体重下降、结肠长度缩短、结肠湿重指数升高、脾脏重量升高。与空白组相比，模型组小鼠在造模第3天出现不同程度的腹泻、血便等情况，体重减轻的情况在第4～5天表现得尤为明显。100 mg/kg组小鼠在第4天出现体重减轻的情况，而在第5天后体重有所回升并在之后超过模型组，除50 mg/kg组小鼠第7天外，其余各组小鼠的体重均大于模型组，见图3(a)。与空白组小鼠相比，模型组小鼠的结肠变短，差异极显著(P<0.001)，而刺梨提取物100 mg/kg和200 mg/kg剂量组小鼠结肠均较模型组长(P<0.05或P<0.01)，见图3(b)。与空白组小鼠相比，模型组小鼠的结肠湿重指数升高，差异显著(P<0.05)，而刺梨提取物各组小鼠结肠湿重指数较模型组均降低，其中100 mg/kg和200 mg/kg剂量组小鼠结肠湿重指数较模型组比具有显著性差异(P<0.01或P<0.001)，见图3(c)。与空白组小鼠相比，模型组小鼠的脾脏重量升高，差异显著(P<0.01)，刺梨提取物100 mg/kg和200 mg/kg剂量组小鼠脾脏重量较模型组降低，其中100 mg/kg组与模型组相比差异显著(P<0.05)，见图3(d)。

与空白组相比，# P<0.05，## P<0.01，### P<0.001；与模型组相比，* P<0.05，** P<0.01，*** P<0.001

2.3.3 结肠黏膜病理学观察 如图4所示，结肠组织进行HE染色后，通过显微镜观察小鼠结肠组织病理切片，发现正常组小鼠结肠的结构完整，纹路清晰；模型组小鼠结肠黏膜层炎性细胞浸润、隐窝结构紊乱或消失、杯状细胞大量丢失等，提示UC模型造模成功。刺梨提取物各组小鼠结肠黏膜相对完整，少数可见浅溃疡，大部分上皮细胞和隐窝结构完整，腺体排列整齐，少量炎症细胞浸润，未见基底淋巴细胞聚集。刺梨提取物各剂量组对UC小鼠肠道黏膜层显示出了较好的保护和修复作用，能降低炎症的严重程度和范围，改善结肠炎症程度，起到黏膜保护作用。

图4 刺梨提取物对各组小鼠结肠组织病理学变化的影响

2.3.4 刺梨提取物对小鼠结肠组织中Keap1及Nrf2蛋白表达的影响 如图5所示，模型组与空白组相比，结肠组织中Keap1的表达水平显著升高(P<0.01)，给予不同剂量刺梨提取物后结肠组织中Keap1的表达水平显著或极显著下调(P<0.01或P<0.001)；与空白组相比，模型组结肠组织中Nrf2的表达水平显著上调(P<0.01)，给予刺梨提取物100 mg/kg 和200 mg/kg能上调Nrf2的表达水平，其中200 mg/kg 组与模型组相比差异显著(P<0.01)。

与空白组相比，## P<0.01；与模型组相比，** P<0.01，*** P<0.001

2.3.5 刺梨提取物对小鼠结肠组织中Keap1及Nrf2蛋白表达的影响 如图6所示，模型组小鼠结肠组织中Keap1的表达与空白组相比明显增加，刺梨提取物各组与模型组比较Keap1表达均有所减少，呈剂量依赖关系。空白组及模型组小鼠结肠中Nrf2的表达较少，刺梨提取物各组Nrf2的表达明显增加，且Nrf2的表达呈剂量依赖关系。

图6 刺梨提取物对小鼠结肠组织中Keap1及Nrf2蛋白表达的影响

3 结论

刺梨提取物能降低由脂多糖诱导RAW264.7细胞NO的释放增加，且呈剂量依赖关系，表现出较强的体外抗炎活性。体内试验发现刺梨提取物对葡聚糖硫酸钠诱导的溃疡性结肠炎具有较好的预防作用，主要体现在能够逆转由葡聚糖硫酸钠所引起的体重降低、结肠长度缩短、结肠湿重指数增加、脾脏指数及疾病活动指数增加；HE染色结果显示，刺梨提取物各组炎性细胞浸润、隐窝破坏程度均降低，提示刺梨提取物能降低炎症的严重程度和范围，对溃疡性结肠炎临床症状和肠道黏膜层显示出了较好的保护和修复作用。刺梨提取物对葡聚糖硫酸钠诱导的溃疡性结肠炎的治疗作用，其可能的机制为下调Keap1的表达水平，上调Nrf2的表达水平，其作用可能与Keap1/Nrf2/ARE信号通路有关。由于刺梨提取物的主要成分为刺梨苷、野蔷薇苷、委陵菜酸、野蔷薇酸和氧代坡模酸[14]，推测刺梨提取物的抗炎作用及治疗溃疡性结肠炎可能与以上成分有关，有待进一步深入研究。