原发灶不明癌溯源定位方法的研究进展*

赵凌昆 李葳 骆惊涛

原发灶不明癌（cancer of unknown primary，CUP）是一种侵袭性疾病，占所有恶性上皮性肿瘤的3%～5%。其中位生存时间为8～11 个月，仅25%患者超过1年，20%～50%的患者无法找到原发病灶。这导致在CUP 的诊断中，通常要依靠经验性化疗，患者预后差，5年生存率较低。故急需确定肿瘤的来源并进行针对性治疗。近年来，已有多种方法可以用于CUP 的原发病灶定位，这些技术将有助于临床上对CUP 进行评估及诊疗，并较好的改善患者的预后。本文对原发灶不明癌的定位方法、研究进展，以及溯源定位技术的应用给予综述，为临床治疗提供新的方法及理论依据。

1 CUP 的概述

流行病学调查数据表明，CUP 占总癌症的3%～5%，是发达国家最常见的10 种恶性肿瘤之一，也是癌症相关的第四大死亡原因[1]。通常CUP 发病时的中位年龄约为60 岁，且男性的发病率略高于女性。在儿童中，CUP 在确诊的实体瘤中所占比例不到1%[2]。荷兰的一项研究报告中表明，患CUP 的风险可能与吸烟和饮酒有关[3]，但有癌症家族史并不是CUP 的独立危险因素[4]。

1.1 CUP 的发生

CUP 不是一个单一的生物实体，而是由不相关的特定部位肿瘤组成的，且所有这些转移肿瘤都具有逃避检测的微小原发肿瘤的特性[5]。在CUP 患者中未发现原发肿瘤的原因可能是成像技术检测微小肿瘤的灵敏度有限、原发肿瘤退化或保持休眠，以及干细胞源性[6]。目前的假说普遍认为其是一种独特的，但尚未被识别的病理实体，起源于特殊的、具有共同特性的干细胞。这种细胞可以在体外分离，并通过连续的移植在体内繁殖，显示出高致瘤性[7]。在对同一个CUP 患者的多个转移瘤进行基因和转录组分析后显示出高度相似性，进一步证明了其来自同一来源[8]。

1.2 CUP 的病理生理学

CUP 在临床上表现多样，淋巴结、肝、骨最常受累[3,9]，大多数CUP 起源于癌症，85%～90 %起源于腺癌和低分化癌、5%～10%起源于鳞癌，5%起源于神经内分泌癌[9]。肺脏是CUP 病变的最常见的原发部位，其次是各种胃肠道肿瘤，而乳腺和前列腺则很少被确定为病变的主要部位[3]。CUP 患者往往死于肺部或肝部等其他器官的转移[10]。研究显示，CUP 患者存在着独立于原发肿瘤的导致转移的遗传特征，在对22例CUP 患者进行下一代测序（next-generation sequencing，NGS）后，检测到268 个基因的共600 个突变，且所有患者都有至少一个或多个基因的改变，如TP53、CDKN2A、SMAD4、BRAF 等[9]。Haratani 等[11]研究表明，CUP 中TP53 的突变率与在其他实体瘤中的突变率相当，这证明TP53 的突变可能在CUP 的发生发展中不起主要作用。

1.3 CUP 的诊治

20世纪70年代初，在尸检未发现原发肿瘤的情况下才能诊断为CUP[12]。目前，关于原发灶不明癌的诊断方法主要包括具有特定标志物的免疫组织化学检测、胸部X 光成像技术、胸部、腹部和骨盆的计算机体层摄影（CT）以及磁共振成像（MRI）和正电子发射断层扫描（PET）等，但是均未能较好的明确原发病灶的位置。在CUP 的治疗中，通常采取经验性基于铂的联合化疗方案，如紫杉醇+铂，或吉西他滨+铂等治疗[12]，但患者的中位生存期仅为6～15 个月[13]。目前，迫切需要从分子层面上对原发灶不明癌进行溯源，以提高治疗的有效性和患者的生存率。一项回顾性研究表明，CUP 具有适合免疫检查点抑制剂（immune checkpoint inhibitors，ICIs）治疗的免疫特性，类似于对ICI 敏感的实体癌症，因此ICIs 是CUP 治疗的一个潜在选择[11]。

2 CUP 的定位方法

近10年来，不同国家的CUP 的发病率呈总体下降的趋势[14]，在一项研究报告中表明，接受癌症特异性药物治疗的患者的生存时间比标准化疗更长[9]。已有一些传统的方法来预测原发病灶位置，如免疫组织化学法、胸部X 光等，其准确度只有20%～30%[15]。有助于活检和确定疾病程度的PET-CT 在CUP 的定位中也有一定的帮助，在原发病灶不明的宫颈癌患者中，44%患者通过PET-CT 发现了原发病灶[16]。目前，分子分类工具已逐渐成熟，如组织蛋白阵列、microRNA 微阵列、寡核苷酸微阵列等方法可以描述肿瘤中的基因或蛋白的表达。基于这些检测方法，可以将CUP 的分子特征与已知肿瘤的分子特征进行匹配，并完成原发病灶的定位。

2.1 光学显微镜和免疫组织化学法检测

免疫组织化学法（immunohistochemistry，IHC）是确定肿瘤类型、亚型以及起源部位的重要的检测工具，并可用于评估组织样本中特定的蛋白表达以确认癌组织的类型并进行诊断[17]。目前，病理学和IHC 检测仍是CUP 诊断的“金标准”[18]。在原发癌和转移癌中，肿瘤通常表达一些组织特有的基因，而这种组织特异性是由调控基因或蛋白质产物所决定的。在原发癌与转移癌的表达谱有一致性的前提下，可应用IHC 检测肿瘤的谱系。虽然其准确度仅有30%左右，但普遍认为通过IHC 来寻找原发癌症是可行的，并可以帮助患者制定更好的治疗方案[18]。

2.2 DNA 微阵列

DNA 微阵列（DNA microarrays）可同时监测数千个基因的表达，可作为癌症分类的一种工具[19]。DNA微阵列有助于高通量地发现肿瘤特异性标记基因，临床上最常使用仍是常规IHC 或其他传统的方法。虽然大多数的实体瘤的分子marker 还未被最终确定[20]，但基于DNA 微阵列/基因芯片（genechip）的肿瘤基因表达谱已广泛被用于癌症的诊断[21]。在一项对14 种肿瘤类型的218 例肿瘤标本和90 例正常组织标本进行寡核苷酸微阵列基因表达分析发现，该方法的总体分类准确率达78%[22]。证明了对原发灶不明癌进行分子分类的可能性，并为CUP 的诊断和临床实施提供了一种新的思路。

在一项前瞻性随机研究中，应用基于微阵列的分类器已在约75%的患者中实现了对原发部位的准确预测[23]，但目前基于微阵列的检测是否具有临床应用所需的灵敏度、特异性尚不清楚，且这种检测方式仍然受制于肿瘤的类型、数量、成本等。

2.3 DNA 甲基化

DNA 甲基化是一种稳定的DNA 的标记物，在不同的肿瘤类型中具有不同的特征[24]。DNA 甲基化的变化可以被用作癌症检测的一个可行的生物标记物。在一项研究中用甲基化EPIC 芯片（Illumina Infinium MethylationEPIC 850k BeadChip）和测序技术分析检测了甲状腺癌组织样本中的全基因组DNA 甲基化模式和基因表达谱，得出其差异甲基化的CpG 位置与区域几乎覆盖整个基因组，这为甲状腺癌的肿瘤发生提供了新的线索[25]。同时，在使用该芯片对正常组织及宫颈癌组织的分析中表明，与正常组织相比，宫颈癌组织中的SEPT9 高度甲基化，为后续的临床治疗提供了可靠的支持与指导意义[26]。

研究显示，基于微阵列DNA 甲基化特征（microarray DNA methylation signatures）建立了一个包含38 种肿瘤类型的分类器来确定原发病灶的位置，在通过光学显微镜以及IHC 等验证后，其准确度高达87%[27]。进一步表明基于DNA 甲基化特征来判断原发不明癌的原发病灶的位置是可行的。同时，探索更灵敏、更特异的DNA 甲基化检测方法，对进一步提高疾病的早期诊断水平具有重要意义，将DNA 甲基化作为诊断CUP 的工具，可作为一种预测最初未确定原发部位的一种方法。虽然仍需进一步的前瞻性临床研究来证明其提高患者的总体生存率，但分子治疗将对肿瘤的特异性治疗的发展至关重要，在确定原始肿瘤类型后进行特定部位的治疗可以改善患者的预后[27]。

2.4 MicroRNA

MicroRNA 是一种小的调节性RNA（约22nt），在癌症中的表达紊乱，其差异表达与肿瘤的形成有关，其参与组织形态的发生、细胞凋亡等细胞过程，是癌症分类和预后的组织标记物[28]。MicroRNA 可以调节特定的mRNA 靶点的活性，并在广泛的生理病理过程中发挥着重要的作用[29]。理想的MicroRNA 标记物是在癌细胞上中高表达而在健康人的血浆中几乎检测不到[30]。MicroRNA 无论是在受损的样本中，还是在生物体液中都具有高度的稳定性和对RNase 酶的抵抗力，且无论组织样本质量如何，MicroRNA 均能被检测到[31]。MicroRNA 的特点支持从FFPE 样本中获得其图谱，进而确定肿瘤的分子特征，并进行快速的CUP溯源[32]。研究证明，在前列腺癌患者中，肿瘤表达的miRNA-141 的血清水平与健康人相比，有显著的特异性和敏感性[32]。且高度稳定的MicroRNAs 是癌症诊断的理想的标志物，有研究测量了64 个MicroRNA 来识别肿瘤的起源，并成功地区分了42 种肿瘤的类型[33]。Laprovitera 等[32]在分析了150 例患者的159份FFPE 样本的89 个MicroRNA 后，推断共53 例包括17 个肿瘤类型的原发病灶未确定的转移性癌，并成功获得了良好的预测准确率。基于MicroRNA 分析虽有助于选择治疗方案，但仍缺乏大量的Ⅲ期临床试验，有必要进行进一步的前瞻性临床研究，以评估基于MicroRNA 的分类器在临床上的使用情况，并证明其对CUP 患者生存的可能影响。

2.5 基因表达谱

与IHC 相比，基因表达谱（gene expression profile，GEP）在确定CUP 的原发部位方面有更高的准确率，尤其是在中、低分化的病例中。依据2022年NCCN 指南，可以通过基因表达谱的分析来辅助CUP 的诊断与制定下一步诊疗计划。

92 基因分子肿瘤谱（molecular tumor profiling，MTP）是一种基于GEP 的检测方法，是一种由92 个基因组成的逆转录聚合酶链式反应监测方法，即通过RT-qPCR 的方法评估92 种基因特征的表达，需在活检组织上进行[34]。有报道[35]利用MTP 分析预测CUP 的原发组织，其准确性为75%。但由于从甲醛固定-石蜡包埋（formalin-fixed paraffin-embedding，FFPE）中提取到的RNA 质量不佳，导致GEP 分析受到限制。在其验证性研究中，该方法可以预测85%的已知原发肿瘤患者的起源组织、可以确定多达30 种肿瘤类型的主要来源[32]。同时，在一项应用该方法的前瞻性研究中，其可识别84%的原发肿瘤部位[16]，这表明与标准的临床评估相比，该方法可以识别更明确的原发肿瘤部位，且在确定CUP 患者起源组织方面是标准病理评估的补充，特别是当IHC 无法确定时，MTP 可以作为一种较好的手段来确定原发病灶位置，但由于可能会存在几种肿瘤出现基因表达重叠、统计偏差、后续治疗路线的选择，以及原发癌症的一致性等情况的出现，会导致对起源组织出现错误的判断，从而无法得出确切的结论。该技术的临床应用已经在一些前瞻性研究中进行了评估，在一项多中心前瞻性Ⅱ期临床试验中，招募了CUP 患者并用该方法进行检测，在成功检测的患者中有67%预测到了起源组织并接受定向治疗，其中位总生存期为13 个月。这与经验性治疗的中位生存期相比，结果有所改善[36]。

2.6 NGS 技术

原发灶不明癌通常具有潜在的靶向性基因组的改变与突变。尤其是对于一些非小细胞肺癌、结直肠癌和黑色素瘤等实体肿瘤的患者，识别有特定治疗方法的基因组的异常可在临床上辅助患者的治疗，并对患者的预后有所改善[16]。

在一项对150 例原发灶不明癌进行NGS 的回顾性研究中，有137 例（91%）出现了至少一种基因的改变，且45 例（30%）具有潜在的靶向性改变，如BRAF基因突变、ERBB2 基因扩增，FEFR 基因融合等[37]，说明靶向治疗是可行的。该研究还发现，在接受靶向治疗的患者中，其治疗效果依旧不佳，最长的生存期仅为14 个月左右。近年来，随着液体活检技术的兴起与成熟，通过检测循环肿瘤DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）来评估CUP 患者的基因组的变化逐渐所熟知，且对CUP 患者的ctDNA 分析显示，其检测出的基因突变率与从肿瘤组织中得出的结果相近。对442 例CUP 患者进行ctDNA 的检测发现，有290例（66%）至少有一种可能是致病性的基因组改变，如RET 基因融合等[38]，其可能会成为一种潜在的新型的检测方法。

通过NGS 检测的基因组异常或其突变模式与原发肿瘤的部位密切相关，有助于识别原发肿瘤的部位。基于NGS 技术开发的共含22 种癌症类型的7 791个样本的基因组学分类器可在其测试集中识别74.1%的肿瘤类型，并可在临床上识别大于50%的可能起源组织，为患者的临床治疗带来了改善[39]。随着NGS 在转移性癌症中的日渐广泛的应用，基于NGS所建立的分类器可能会提供更多的机会来识别CUP中的肿瘤类型。

3 结语

CUP 是一种经组织学证实的转移性恶性肿瘤，其原发肿瘤部位在标准评估和影像研究的基础上无法识别。CUP 因无针对性诊疗措施、患者预后不良而被广泛研究，并代表一组不同的恶性肿瘤，具有独特的临床行为和独特的生物学特征，以侵袭性、早期转移，以及不可预测的扩散模式为主要特点。大多数CUP 患者最初表现为转移性疾病，常累及淋巴结、肝脏、骨和肺脏。经验性化疗如紫杉醇+铂，或吉西他滨+铂等是最常见的治疗策略，手术和放疗在化疗中通常起到辅助治疗效果的作用。目前，针对CUP 的化疗方案尚未显著改善患者的预后。由于无标准的CUP 化疗方案，且经验性治疗的获益低，对起源组织的准确识别和对特定部位的治疗将有可能改善CUP 患者的状况。尸检结果表明，CUP 的原发部位主要集中于肺脏、胰腺、肝胆等部位，但现有的治疗或检测手段如IHC、PETCT、X 光等都无法较好的准确定位原发病灶位置[27]。近年来，越来越多的更精准的方法如NGS 技术、MicroRNA 检测、DNA 甲基化芯片、基因表达谱等可在很大程度上确定原发病灶位置并可以指导临床的下一步治疗。随着新的预测生物标记物和靶向治疗的确定，现代肿瘤学的治疗越来越强调个性化，未来CUP 的原发病灶定位将更加精准，将更好地辅助临床治疗并进一步改善患者的预后与生存。