铁死亡抑制蛋白1在铁死亡相关疾病中的研究进展

沈惟钰, 吴艳, 卞涛

随着人们对细胞死亡的不断探究, 细胞死亡也被细分为了凋亡、铁死亡、焦亡、溶酶体依赖性死亡, 自噬依赖性死亡等多种死亡方式[1］。其中铁死亡是近年来发现的一种新的、非凋亡性的细胞死亡, 以细胞中铁和活性氧的积蓄, 脂质过氧化和抗脂质过氧化的失衡为特征[2］。这种细胞死亡方式表现为当细胞内游离铁增多时, 一方面会通过芬顿反应产生更多的活性氧, 将细胞膜上的多聚不饱和脂肪酸氧化成脂质过氧化物；另一方面可将脂质过氧化物进一步催化为有毒的脂质自由基, 导致细胞死亡[3］。Xc-/谷胱甘肽（glutathion, GSH）/谷胱甘肽过氧化物酶4（glutathione peroxidase 4, GPX4）作为经典的抗氧化途径在铁死亡的过程中发挥了重要的抑制作用。在GPX4的催化下, GSH可以将脂质过氧化物还原为脂肪醇, 从而中断铁死亡；而细胞内GSH的生成依赖于胱氨酸/谷氨酸逆向转运蛋白System Xc-对胱氨酸的转运[4］。因此, 这三者共同构成了铁死亡的经典抑制途径Xc-/GSH/GPX4。此外, 最新的研究显示FSP1不仅参与细胞凋亡[5-6］, 其在铁死亡中也具有重要的抑制作用, 且独立于上述的经典铁死亡抑制途径[7］。本研究将从FSP1调控铁死亡的机制入手, 对其与铁死亡相关疾病, 尤其是与肿瘤的关系进行综述与展望。

1 FSP1的基因表达和蛋白结构

FSP1是一种高度保守的黄素蛋白, 起初被认为是p53的应答基因[8］, 因为其与凋亡诱导因子（apoptosis-inducing factor, AIF）——一种人胱天蛋白酶（caspase）-非依赖性促凋亡蛋白有一定的结构相似性, 也被称为线粒体相关凋亡诱导因子（apoptosis inducing factor mitochondria-associated, AIFM2）[9］。由于最近发现FSP1具有抑制细胞铁死亡的作用, 为避免混淆将其重新命名为FSP1[7］。FSP1基因定位于人染色体10q22.1, 编码包含373个氨基酸、分子量约为40.5 kDa的蛋白质[8］, FSP1的结构主要包括：一个还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）氧化还原酶结构域, 具有NAD（P）H氧化酶活性, 催化NAD（P）H依赖的细胞色素c和其他电子受体（包括分子氧）的还原；一个DNA结合域, 可以和DNA非特异性结合, 产生蛋白质构象改变, 这可能会降低FSP1的氧化还原酶活性以及导致细胞的凋亡；另一个是黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）结构域, 可与辅因子FAD结合。FSP1主要位于细胞质中, 可通过其N端与细胞膜内的磷脂共价结合；与AIF不同的是, FSP1缺乏线粒体定位序列（mitochondrial localization sequence, MLS）, 与线粒体外膜之间存在一定的亲和力, 黏附在线粒体外膜上并形成环状结构[10］。

2 FSP1与铁死亡

2.1 FSP1铁死亡抑制功能的发现酰基辅酶A合成酶长链家族成员（4acyl-CoA synthetase long chain family member 4, ACSL4）是铁死亡的前基因, 其表达水平决定细胞对铁死亡的敏感性；GPX4被认为是抑制铁死亡的重要调节因子[11］。然而, 在某些癌细胞系中, 无论ASCL4的表达水平如何, 抑制GPX4不能引发铁死亡, 这表明对于某些细胞来说, 存在一些平行的保护途径来对抗铁死亡。因此, Doll等[7］构建了耐铁死亡细胞系的互补DNA（cDNA）文库, 并对14个GPX4基因敲除的存活细胞克隆进行了Sanger测序分析, 发现FSP1在缺乏GPX4的细胞中能对抗铁死亡。

2.2 FSP1抑制铁死亡的作用机制FSP1抑制铁死亡的功能与它具有NADH：泛醌（CoQ）10的氧化还原酶活性密切相关, 它通过N-肉豆蔻酰化靶向质膜, 在质膜上FSP1氧化NAD（P）H, 并将CoQ10还原为二氢泛醌（CoQH2）[7, 12］, 而CoQH2则是一种亲脂性自由基捕获抗氧化剂, 具有很强的抗氧化作用, 可以减少细胞内活性氧和脂质自由基[13］, 从而对抗铁死亡。进一步的研究发现FSP1抑制铁死亡的功能与细胞GSH水平、GPX4活性、ACSL4的表达和可氧化脂肪酸含量无关, FSP1/NADH/CoQ10途径独立于Xc-/GSH/GPX4途径发挥抑制铁死亡的作用[7］；而在GPX4表达水平正常的情况下, FSP1的缺失也会导致磷脂过氧化的增加[12］, 提示 FSP1/NADH/CoQ10途径与Xc-/GSH/GPX4途径还存在协同作用。此外, FSP1也可能通过ESCRT-Ⅲ依赖的膜修复机制来抑制铁死亡, 但具体的调节机制仍不明确[14］。

2.3 FSP1铁死亡抑制作用的调节FSP1是通过N-肉豆蔻酰化与质膜中的磷脂共价结合的, 因此N-肉豆蔻酰基转移酶抑制剂或者蛋白发生Gly-Ala（G2A）突变（甘氨酸是唯一可以作为肉豆蔻酰基转移酶底物的残基）, 可使FSP1无法富集到细胞膜上, 丧失抑制铁死亡的功能[15］。iFSP1是一种由Doll等[7］筛选出来的FSP1抑制剂, 可以选择性地抑制FSP1抗铁死亡的功能, 诱导过表达FSP1的GPX4 敲除细胞发生铁死亡, 但iFSP1抑制FSP1抗铁死亡功能的具体作用机制仍不明确。由于CoQ10是FSP1的主要底物, 抑制CoQ10的生成可以显著降低FSP1阻止脂质过氧化的功能, 例如铁死亡诱导剂FIN56[16］和他汀类药物[17］可以通过抑制3-羟基-3-甲基戊二酸单酰CoA还原酶, 从而抑制生成CoQ10的甲羟戊酸途径（MVA pathway）, 进而降低体内CoQ10含量, 抑制FSP1/NADH/CoQ10途径, 增加细胞对于铁死亡的敏感性。值得注意的是, 4-羟基-2-壬烯醛是铁死亡的产物之一, 有研究显示它可以直接结合于FSP1的氧化还原酶域, 抑制FSP1作为氧化还原酶的活性[15］。FSP1氧化还原酶活性的降低会进一步加剧铁死亡, 形成一个正反馈循环, 引发细胞的大量死亡, 这可能是机体对于癌细胞的自我防御措施之一, 需要进一步的研究。

3 FSP1与铁死亡相关疾病的关系

3.1 FSP1与肿瘤的关系细胞内活性氧多来自于自身的线粒体的氧化代谢过程, 肿瘤组织由于其比一般正常组织具有更强的代谢功能以及线粒体活性, 容易比正常组织产生更多的活性氧[18］。这使得肿瘤细胞严重依赖抗氧化机制, 甚至相对于正常细胞更容易受到氧化应激和铁死亡的影响[19］。因此, 高度增殖的肿瘤细胞需要够降低细胞活性氧水平, 调控铁死亡, 在肿瘤的增殖和发育中发挥重要作用。

3.1.1 FSP1与肺癌 FSP1可以用于预肺癌患者的预后及指导用药。Bersuker等[12］发现 FSP1的表达与肺癌细胞对多种GPX4抑制剂（RSL3、ML210和ML162）的耐药性呈正相关, 敏感性甚至高于system xc-和SLC7A119。此外, 敲除FSP1的肺癌细胞对铁死亡诱导剂显示出更高的敏感性, 例如在高耐药的H460细胞系中敲除FSP1可以提高100倍对RSL3的敏感性[12］。并且在非小细胞肺癌中, FSP1的过表达可以抑制顺铂诱发的铁死亡, 增强非小细胞肺癌的耐药性[20］。因此, FSP1可以作为肺癌中铁死亡抵抗的生物标志物并可用于预测癌症中诱导铁死亡药物的疗效。

3.1.2 FSP1与葡萄膜黑色素瘤 有学者将7 025个葡萄膜黑色素瘤潜在的预后基因与103个铁死亡相关基因相交, 得到了一个包含22个基因的交集, 随后将此22个基因放入套索COX回归模型中筛选出了7个可以用于预测葡萄膜黑色素瘤预后的铁死亡相关基因[21］。其中, FSP1在高风险组中过表达, 可以考虑作为葡萄膜黑色素瘤患者经治疗预后不佳的标志物。

3.1.3 FSP1与消化系统肿瘤 FSP1还可以通过上调ESCRT-Ⅲ抑制胰腺癌及肝癌细胞中的铁死亡, 增加肝癌细胞对索拉菲尼的耐药性。用shRNAs敲除人胰腺癌细胞和人肝癌细胞中的FSP1基因, 会增强这两种细胞对Erastin、索拉非尼和RSL3等铁死亡诱导剂的敏感性, 重要的是这种变化可以在加入铁死亡抑制剂Liproxstatin-1后缓解, 但不能被CoQ拯救[14］, 提示在这两种消化系统肿瘤中存在着FSP1参与的不同于FSP1/NADH/CoQ10途径的铁死亡调控途径。进一步的研究发现FSP1可以在质膜上募集ESCRT-Ⅲ, 通过促进细胞膜修复来抑制铁死亡[14］。

3.1.4 FSP1与肿瘤微环境 CD8+T细胞是肿瘤微环境中一种重要的肿瘤拮抗免疫细胞[22］。过表达FSP1的CD8+T细胞中脂质过氧化水平明显降低, 但细胞发生铁死亡的比率并未明显下降, CD8+T细胞的抗肿瘤功能也未提高；然而该研究未进行FSP1抑制或者敲除情况下, CD8+T细胞铁死亡比率及抗肿瘤功能变化的探索[23］。因此, 目前并不清楚在抑制FSP1治疗肿瘤的同时, 是否会损伤自身的免疫系统, 这对FSP1靶向药物的研发提出了更高的要求。

3.2 FSP1与神经退行性疾病帕金森病是一种中老年人常见的神经退行性疾病, 细胞铁死亡的过程与其生理病理特征高度吻合[24］。此外, 在帕金森病小鼠模型中, GPX4及FSP1表达明显降低。使用去铁铁蛋白预处理后, GPX4表达仍然降低, 但FSP1表达回升, 并可显著改善小鼠的运动障碍[25］。这些结果表明FSP1可以单独作为帕金森病的治疗靶点。

3.3 其他在急性肾损伤的小鼠模型中, FSP1的缺失被证明是导致肾小管上皮细胞铁死亡的重要因素之一, 但补充FSP1是否对急性肾损伤具有治疗作用还有待研究[26］。活性氧介导的细胞死亡是类风湿性关节炎病情进展的关键, FSP1的降低会激活肿瘤坏死因子-α（TNF-α）/ROS反馈回路, 进而诱发类风湿性关节炎[27］。

4 总结和展望

综上所述, FSP1作为铁死亡的抑制蛋白, 介导了平行于Xc-/GSH/GPX4途径的FSP1/NADH/CoQ10铁死亡抑制途径。FSP1既可以作为部分肿瘤铁死亡抵抗及预后的生物标志物, 也为抗肿瘤药物的研发提供了新的思路与方向, 尤其是针对MVA途径的药物, 可以同时降低FSP1的底物CoQ10与另一重要的铁死亡抑制蛋白GPX4的产生, 更充分地诱导肿瘤细胞发生铁死亡, 达到事半功倍的效果。然而, 目前对于FSP1介导的铁死亡抵抗的最新研究主要集中在肿瘤领域, 在其他铁死亡相关疾病如慢性阻塞性肺疾病、缺血再灌注、炎症性疾病等临床疾病中, 人们对于FSP1作用的研究甚少。因此, 利用先进的科学技术手段, 进一步详细地研究FSP1的铁死亡抑制作用, 有助于人们更客观全面地认知包括但不限于肿瘤在内的铁死亡相关疾病的发生与进展, 制订更完备的铁死亡相关疾病的预防与诊疗方案。