2 种不同乳脂球膜对小鼠智力、抗疲劳及抗氧化功能的作用

温欣怡，邹潇潇，罗永康，谭雨青*

（中国农业大学食品科学与营养工程学院，北京 100083）

乳作为哺乳动物用于哺育后代幼体的乳腺分泌物，其成分复杂且营养丰富，较全面地涵盖了糖类、蛋白、脂质、无机盐及微量元素等常见的生命维持所需营养物，同时还可提供低聚糖、免疫球蛋白等重要的活性物质。其中，占比3%～5%的乳脂肪是乳的重要组成成分，主要以乳脂球的形式存在于乳中。包裹乳脂球外表的膜结构即为乳脂球膜（milk fat globule membrane，MFGM），其膜结构共包括3 层，从内到外分别为由极性脂质和蛋白质组成的单层膜结构及来自顶端质膜的脂双层膜结构[1-2]。单层膜结构内膜包裹着乳脂球的内核脂滴，双层膜的内表面则附着有电子致密的蛋白质[3-4]。

近年来，有关MFGM的成分研究越来越多，并且随着分离、纯化和分析技术逐渐发展，对于MFGM的成分有了进一步的认识。MFGM是由许多生物活性成分组成的，如蛋白质、磷脂、胆固醇等[1,5]。其中磷脂、鞘磷脂、蛋白质等多种营养成分具有促进生长发育[5-7]、调节机体代谢和免疫[1,8-10]、改善肠道功能等多种有益功能。MFGM不仅能提供包含膜结合蛋白在内的多种蛋白质[11]，还能提供包括磷脂在内的生物膜组成成分[12]，除了有助于幼儿大脑发育外，在被其他人群摄入后可能还会发挥潜在的益智功效[13-14]。此外，由于现代的快节奏生活，常常使得人们难以及时休息调整，长此以往形成慢性疲劳综合症，严重时可能引起生物调节紊乱等多种疾病，甚至导致“过劳死”[15-17]。目前，休息、营养补充和药物治疗等方法可以缓解机体的疲劳[18]。而天然来源的抗疲劳功能性成分由于毒副作用小、生物活性高及安全性高，受到了学者的广泛关注和研究。

本研究分别以2 种不同的MFGM为原料，以BALB/c雄性小鼠作为动物模型，分别设置处理组1（MFGM1）、处理组2（MFGM2）和空白组（生理盐水），通过水迷宫实验、脑指数测定、力竭游泳实验、自由泳实验、血清生化指标测定[19-21]、血清抗氧化指标测定[22-27]和能量储备指标测定[28]，比较不同种类MFGM对小鼠益智、抗疲劳及抗氧化的调节作用差异，以期为食源性活性成分新产品的开发提供新的思路参考，为研发MFGM相关的功能保健食品提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

24 只7 周龄、健康的SPF级BALB/c雄性小鼠，体质量18～22 g，购自北京维通利华实验技术有限公司。动物喂养及实验设计严格按照《北京市实验动物管理条例》执行，并经过北京大学医学部伦理委员会审核通过（批准号：LA2021477）。

MFGM1 丹麦Arla公司；MFGM2 美国Hilmar公司。

普通维持饲料 北京科奥协力饲料有限公司；乳酸（lactic acid，LD）、血氨、乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、过氧化氢酶（catalase，CAT）、谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）测定试剂盒 南京建成生物科技有限公司。

1.2 仪器与设备

1056001水迷宫 北京众实迪创科技发展有限责任公司；GL-21M高速冷冻离心机 湖南平凡科技有限公司；1-14非冷冻微离心机 德国Sigma Laborzentrifugen公司；NO.G560E旋涡混合器 美国Scientific Industries公司；SP0103A1911001多功能酶标仪 上海闪普生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 小鼠分组及处理

将24 只健康SPF级BALB/c雄性小鼠适应性喂养1 周后按体质量随机分为3 组，每组8 只。组别包括空白组（灌胃无菌生理盐水）和2 个不同MFGM处理组（分别灌胃MFGM1和MFGM2，并命名为处理组1和处理组2）。MFGM灌胃液以无菌生理盐水配制，质量浓度为10 mg/mL。各组灌胃体积均为10 mL/kg[29-30]，即灌胃量为100 mg/kg，每日1 次经口给予，连续干预18 周。在小鼠的饲养过程中，每3 d称取小鼠体质量并记录。

1.3.2 MFGM对小鼠益智功能的影响

1.3.2.1 Morris水迷宫实验

Morris水迷宫是一个直径120 cm的圆柱形水池。为便于观察和统计，将迷宫池随机划分为4 个象限，在第1象限中放置一个圆柱型安全平台，平台高度为低于水面1 cm，整个实验期间平台位置保持不变。在水迷宫上方安置一高清摄像机记录小鼠的游泳情况，为确保仪器能准确记录小鼠的游泳情况，向水中加入20 g食用级黑色素。

实验前对小鼠进行训练，依次从第1至第4象限将小鼠面向池壁轻放入水中，记录其寻找并爬上平台所需的时间（即逃避潜伏期）和游泳轨迹，规定最长寻找时间为60 s，若60 s内未找到安全平台，则须用木棍将其引导至平台上，停留10 s[31]。实验共训练5 d。训练结束后，进行空间搜索实验。

空间搜索实验时将水迷宫中的安全平台撤去，将小鼠从第3象限的同一入水点面向池壁放入水中，记录小鼠在60 s内穿越平台总次数、目标象限路程比和目标象限时间比（即小鼠在原平台所在象限的路程和时间占总路程和总时间的比率）。

1.3.2.2 脑指数测定

连续灌胃18 周后将小鼠处死，取出脑，用滤纸吸干表面血污，称质量并按下式计算脑指数[32]。

1.3.3 MFGM对小鼠抗疲劳功能的影响

通过力竭游泳实验、自由泳实验、血清生化指标测定和能量储备指标测定，探究MFGM对BALB/c小鼠抗疲劳能力的调节作用。

1.3.3.1 力竭游泳实验

根据1.3.1节连续灌胃6 周和14 周后进行力竭游泳实验。灌胃结束30 min后，在小鼠尾巴根部绑上质量占体质量7%的铅块，将小鼠放入游泳池中，游泳池水深30 cm以上，水温为（25.0±1.0）℃。记录各小鼠游泳至力竭的时间，小鼠力竭的评价标准为鼻尖沉入水中连续7 s不能上浮[33]。

1.3.3.2 自由泳实验

根据1.3.1节连续灌胃16 周后进行自由泳实验。灌胃结束30 min后，将小鼠放入游泳池中，游泳池水深30 cm以上，水温为（25.0±1.0）℃。使小鼠不负重游泳60 min，取出擦干后立即颌下取血。

1.3.3.3 能量储备指标测定

在16 周自由泳实验以及18 周（禁食8 h）处死后取血，血样在4 ℃静置1 h后1 180×g离心10 min取血清，然后按照试剂盒说明书中的步骤，测定血清中的血糖含量。

1.3.3.4 血清生化指标测定

在16 周自由泳实验并颌下取血后，血样在4 ℃静置1 h后1 180×g离心10 min取血清。根据各试剂盒说明书测定血清中LD、血氨、LDH和SOD的含量。

1.3.4 MFGM对小鼠抗氧化功能的影响

根据1.3.1节连续灌胃18 周后，禁食8 h，摘眼球取血。血样在4 ℃静置1 h后1 180×g离心10 min取血清，然后按照各试剂盒说明书中的步骤测定血清中CAT、GSH-Px、SOD活性及MDA含量。

1.4 数据处理

用SPSS 25.0软件对数据进行分析。连续变量数据用平均值±标准差表示，使用单因素方差分析和Tukey法进行各组间显著性分析，P＜0.05被认为具有统计学上的显著差异。

2 结果与分析

2.1 MFGM干预对小鼠体质量的影响

体质量与动物的身体状况息息相关，体质量正常稳定的增长表明该受试物对机体没有毒副作用，同时，体质量稳定且保持在一定范围，可以保证动物机体处于正常情况，避免对实验结果造成不必要的影响。由图1可知，BALB/c小鼠在灌胃MFGM过程中，开始灌胃第1天时，各组小鼠体质量之间无显著差异，连续灌胃18 周后，各组的体质量差值仍无显著差异。说明灌胃MFGM不会导致小鼠体质量的异常变化。

图1 MFGM干预对小鼠体质量的影响Fig.1 Effect of MFGM on the body mass of mice

2.2 MFGM干预对小鼠益智功能的影响

2.2.1 MFGM干预对小鼠水迷宫实验定位航行和空间搜索的影响

Morris水迷宫实验是重要的评价学习认知能力的动物行为学实验，在空间搜索实验中，记录60 s内平台在1 min内的被穿越次数、其所在象限的时间比及路程比，只数越多、次数越多及比值越大表明学习能力及空间记忆能力越强[34]。由表1可知，MFGM干预13 周后，灌胃2 种MFGM小鼠的平台穿越总次数、目标象限路程比和时间比均有增加。说明灌胃MFGM的小鼠具有良好的学习记忆能力，MFGM能够改善小鼠的空间记忆和学习能力，但是2 种不同的MFGM之间没有显著性差异。

表1 各组小鼠穿越平台总次数、目标象限路程比和目标象限时间比Table 1 Number of crossing over the platform, distance ratio of target quadrant and time ratio of target quadrant in each group of mice

由图2可知：空白组小鼠入水后无法找到平台所在象限（第1象限），且游泳路径一直在水域边缘，表明其学习记忆能力较差；而处理组1和处理组2小鼠入水后，回忆起了平台所在地点，虽然平台已经撤去，但仍一直在平台原有位置和所在象限（第1象限）寻找，表明其具有良好的学习记忆能力。说明MFGM能够改善小鼠的空间记忆和学习能力。

图2 空间搜索实验中小鼠典型路线图Fig.2 Typical road maps of mice in the spatial search test

2.2.2 MFGM干预对小鼠脑指数的影响

脑或神经系统的大小和动物学习认知能力相关，脑指数的大小一定程度上反映动物智力的大小[35]。由图3可知，MFGM干预18 周后，2 种MFGM处理组与空白组的脑指数都出现显著差异，其中处理组1和处理组2的脑指数没有显著性差异。有研究[35-36]表明，在一些病理情况下，如衰老、亚慢性铝暴露会导致脑指数甚至海马体指数显著降低，大脑中相关蛋白表达受到影响，进而引起动物的神经系统损伤，在本研究中，2 种不同的MFGM都能使BALB/c小鼠脑指数增大，结果可能预示着MFGM在非药物性治疗脑部相关疾病方面有着积极作用。2 种不同MFGM处理后小鼠的脑指数无显著性差异，MFGM种类及生产加工方法是否会对其造成影响需进一步的研究证明。

图3 MFGM干预对小鼠脑指数的影响Fig.3 Effects of MFGM on brain indices of mice

2.3 MFGM干预对小鼠抗疲劳功能的影响

2.3.1 MFGM干预对小鼠力竭游泳时间的影响

在受试物的干预下，力竭游泳时间的延长能够直观反映该物质的抗疲劳效果[37]。由图4可知，随着小鼠的生长，所有小组的力竭游泳时间都有一定的延长，而在灌胃第6周时，处理组2的力竭游泳时间与空白组差异显著（P＜0.05），处理组1小鼠的力竭游泳时间有所延长，但是与空白组无显著差异。灌胃第14周时，各处理组小鼠的力竭游泳时间均与空白组无显著差异，这可能和干预用的MFGM剂量较低有关。

图4 MFGM干预对小鼠力竭游泳时间的影响Fig.4 Effects of MFGM on exhaustive swimming time of mice

2.3.2 MFGM干预对小鼠能量储备的影响

在疲劳的产生机制中，疲劳形成原因包含有能量供给物质的消耗用尽，因此相关物质的及时补充摄入被认为是疲劳缓解举措之一[38]。其中，血糖是能清晰反映机体内能量供给状况的重要指标之一，在对应的合适范围内，其水平的升高表明腺嘌呤核苷三磷酸的产出速率提升，进而利于机体抗疲劳[28]。

由图5可知：在第16周时，处理组1和处理组2的血糖含量比空白组有所提高，但与空白组均无显著差异，其中处理组2的提升略高于处理组1；在第18周时，处理组2血糖含量与空白组差异高度显著（P＜0.001），处理组1血糖含量也有所升高，但与空白组无显著差异，且处理组2血糖含量比处理组1显著提高（P＜0.05）。实验表明MFGM能够显著提升小鼠的能量储备，提高机体的抗疲劳能力。现已发现支链氨基酸（包括缬氨酸、亮氨酸及异亮氨酸）的补充对于运动所需储备能量的提供、肌肉中蛋白的合成、运动性疲劳的延迟及消除等具有积极的调节作用[39]。由此可推测，MFGM可能通过提供较为丰富的支链氨基酸以改变小鼠运动时体内（尤其是血清）的支链氨基酸含量，进而改变支链氨基酸的代谢状况以缓解疲劳。研究结果表明，处理组2血糖含量的提高显著优于处理组1，即MFGM2通过提高能量储备改善机体抗疲劳能力的效果优于MFGM1，这可能和不同MFGM中含有的不同磷脂[40]、活性蛋白[41-43]等微量成分的种类与含量有关。

图5 MFGM干预对小鼠血糖含量的影响Fig.5 Effects of MFGM on blood glucose levels of mice

2.3.3 MFGM干预对小鼠运动代谢产物的影响

在剧烈运动下，机体有氧代谢能力逐渐达到极限，此时机体葡萄糖的供能方式会由有氧氧化转化为无氧酵解，而LD是后者的最终产物[41-43]。LD的积累会导致肌肉组织pH值下降，内环境变化引起各类能量代谢酶的活力受到抑制，进而引起疲劳[44-45]。而若运动过程中糖原等物质不能得到及时补充，蛋白质和氨基酸则会被消耗降解，产生大量氨进入血液，此时柠檬酸脱氢酶等代谢酶的活力会受到抑制，影响机体正常的能量代谢，从而引起疲劳[46-47]。

LDH是LD代谢的关键酶，正常情况下存在于肌肉组织中。机体内LD正常的代谢途径为：经尿液排出体外；经过糖异生途径转化为葡萄糖；在LDH作用下，LD被转化为丙酮酸，经过三羧酸循环供能。但是，长时间剧烈运动会破坏肌肉细胞的通透性，致使LDH进入血液中，导致血清LDH含量上升[48]。血清中LDH的含量能够表明运动过程中肌肉细胞的损伤程度。

由图6可知，处理组1和处理组2的血清LD含量与空白组相比均显著降低，其中处理组2（P＜0.001）的改善效果显著优于处理组1（P＜0.01），但处理组2与处理组1间无显著差异；相比于空白组，处理组1和处理组2血氨含量均显著降低，其中处理组2（P＜0.000 1）的改善效果显著优于处理组1（P＜0.01），但处理组2与处理组1间无显著差异。这可能是因为MFGM的干预提高了小鼠糖原的储备，此时机体有氧代谢能力提升，LD的形成量减少，且相同运动量下蛋白质和氨基酸消耗降解量少，即产生的氨也随之减少，最终达到缓解剧烈运动下疲劳的效果。

图6 MFGM干预对小鼠运动代谢产物的影响Fig.6 Effects of MFGM on exercise-induced metabolites levels of mice

与空白组相比，处理组1和处理组2血清LDH含量均显著降低，其中处理组1（P＜0.001）的改善效果较处理组2（P＜0.05）好，但处理组1与处理组2间无显著差异。说明MFGM干预能够缓解剧烈运动中的肌肉细胞损伤，提高机体的抗疲劳能力，这可能是MFGM的干预提高了小鼠糖原的储备，此时机体有氧代谢能力提升，LD、血氨和LDH等代谢废物的形成量减少，最终使得剧烈运动下的疲劳程度得到缓解。

2.4 MFGM干预对小鼠抗氧化功能的影响

疲劳发生机制中，自由基理论受到学者们的广泛关注和研究。自由基具有极强的氧化能力，主要分为活性氧自由基（reactive oxygen species，ROS）和脂质自由基。在正常的机体内，自由基会被包括抗氧化酶在内的氧化防御体系清灭，进而维持动态平衡。当失衡时，自由基会破坏细胞内的蛋白质、核酸等大分子，损坏细胞结构，进而引起疲劳[49]。抗氧化酶可以清除自由基，缓解机体的疲劳程度。如SOD可以催化ROS生成H2O2和O2，而GSH-Px可以进一步催化H2O2变为H2O和O2。因而，此类抗氧化酶的活力可以较好地用于表征生物体内的抗氧化能力。此外，机体内活性氧的大量积累会加剧肝脏和肌肉中的脂质过氧化进程，如MDA这样活力较高的脂质降解产物还能进一步与蛋白反应，进而干扰组织正常结构及功能[50]，因此其含量可较好地间接反映机体内氧化受损状况。

由图7可知，在第16周自由泳后取血清测定SOD的活力，发现相比空白组，处理组1 SOD的活力提升10.94%（P＜0.000 1），处理组2 SOD的活力略有提升，但无显著差异。其中处理组1的改善效果显著优于处理组2（P＜0.01）。连续灌胃18 周后，空腹8 h处死取血，各处理组和空白组血清中SOD活力均无显著差异；处理组2 CAT活力相比空白组提升30.25%，但无显著差异；处理组1和处理组2的GSH-Px活力都有极显著提升（P＜0.01），相比空白组分别提升19.34%和26.56%；2 种MFGM均导致MDA含量的极显著下降（P＜0.01），处理组1和处理组2相比空白组分别降低54.72%和54.74%，空白组小鼠血清MDA最高极可能意味着最高强度的机体氧化损伤。

图7 MFGM干预对小鼠抗氧化酶活力及MDA含量的影响Fig.7 Effects of MFGM on antioxidant enzyme activities and MDA levels of mice

尽管疲劳是一个涉及多类组织的复杂生化过程，但基于自由基理论出发的许多抗氧化物质已被证明具有抗疲劳功效，包括食源性多酚、蛋白酶解物（活性肽及氨基酸类）、多糖、维生素类、皂苷类等[51]。同样，已有研究发现MFGM可通过加强小鼠体内SOD活力、降低组织中MDA含量并改善线粒体功能以减轻高脂饮食诱导的肝脏脂肪变性[52]。综上所述，MFGM很可能通过提升机体总抗氧化力来缓解小鼠疲劳，包括抗氧化酶活力的增强及生物膜脂质过氧化反应的抑制作用。

3 结 论

本研究比较了2 种不同的MFGM对小鼠益智、抗疲劳及抗氧化功能的影响。结果表明，MFGM1增强小鼠学习认知及空间记忆能力的功能优于MFGM2，MFGM1处理组的小鼠水迷宫实验目标象限总路程比MFGM2处理组小鼠多出72.21%，且目标象限总时间比多出57.06%；而MFGM2提高机体抗疲劳能力的功能优于MFGM1，MFGM2处理的小鼠力竭游泳时间、血糖含量、血清LD含量、血氨含量等多个指标改善程度均显著优于MFGM1。

本研究结果表明MFGM具有一定的益智、抗疲劳和抗氧化作用，MFGM的制备方法和具体成分可能会对其有益作用造成影响，研究结果能为MFGM未来的研究指出方向，有助于MFGM的产业化实际应用。