参葛颗粒水提及纯化工艺研究

张蓓 李国文

（1.上海中医药大学市中西医结合临床医学院 上海 201203；2.上海中医药大学附属上海市中西医结合医院药剂科 上海 200082）

参葛颗粒为上海中医药大学附属曙光医院内制剂，由丹参、葛根、炒白术、片姜黄、垂盆草、女贞子等组方，方中丹参活血化瘀；葛根清热生津、升清排浊；白术健脾益气、燥湿利水；姜黄芳香健胃，可活血行气；垂盆草清热利湿退黄；女贞子养阴益肾、补气舒肝，诸药配伍，共奏健脾祛痰、化湿活血之效。前期药理实验和临床研究表明参葛颗粒对非酒精性脂肪肝病有较好的疗效[1-2]。目前用于治疗此病的中药方剂众多，常用的主要方剂有健脾疏肝方、健脾化痰方、疏肝调脂方、益气补肾调脂方及一些自拟方剂[3]。研究表明参葛颗粒能够显著降低患者血清谷丙转氨酶、谷草转氨酶、谷氨酰转肽酶水平（P＜0.05），具有保肝降酶的作用；还可明显降低血清总胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白胆固醇水平（P＜0.05），说明其能够改善脂质代谢，还能够有效改善中医证候积分，缓解临床症状（P＜0.05）[1]。参葛颗粒能增加血清脂联素水平，激活AMP依赖的蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）信号，增加PGC1-α及Nrf2表达水平，发挥抗氧化作用。这可能是参葛方治疗非酒精性脂肪性肝炎的作用机制之一[4]。方中姜黄，炒白术的主要有效成分为挥发油，由于这类成分具有较强的挥发性，故采用水蒸气蒸馏法提取挥发油后，药渣与其他药材合并提取。丹参的水溶性酚酸类成分[5]、葛根中所含异黄酮类化合物均为其有效成分[6]，应对其质量进行有效控制。本方药味多、剂量大，为了最大限度地减少浸膏量，提高有效成分的含量，对参葛颗粒水提及乙醇沉淀工艺参数进行研究，结合实际条件，确定最佳水提及纯化工艺条件[7]。本实验以水为溶媒进行有效成分的提取，并采用乙醇沉淀的方式进行纯化，以期为该中药制剂的临床推广提供技术支撑。

1 材料和方法

1.1 仪器

Agilent 1100高效液相色谱仪（美国安捷伦科技有限公司）；Kromasil 100-5 C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5.0 μm，Akzo Nobel公司）；Senco R206B 旋转蒸发仪（上海申生科技有限公司）；Sartorius CPA225D 电子天平（赛多利斯公司）；3K18型小型台式冷冻离心机（美国Sigma公司）。

1.2 试药

丹参、葛根、炒白术、片姜黄、垂盆草、女贞子均购于上海康桥中药饮片有限公司，经上海中医药大学教学实验中心鉴定均符合2020年版《中国药典》的标准；丹酚酸B对照品（批号11562-200908）、葛根素对照品（批号110752-200511）均购自中国药品生物制品检定所；乙腈和甲醇（色谱级，霍尼韦尔公司）；纯化水自制；其余试剂均为市售分析纯。

1.3 方法

1.3.1 丹酚酸B测定

1）对照品溶液的配制 取适量丹酚酸B对照品，精密称定，以75%甲醇制成每1 mL含45 μg的溶液。

2）供试品溶液的配制 精密移取浓缩液0.5 mL，以75%甲醇溶解并定容至50 mL，离心（13 000 r/min，10 min）后取上清液作为供试品溶液。

3）色谱条件 流动相为甲醇-乙腈-甲酸-水（30∶10∶1∶59）；检测波长286 nm；柱温40 ℃；体积流量1.0 mL/min；进样量10 μL。

1.3.2 葛根素测定

1）对照品溶液的配制 葛根素对照品适量，精密称定，用甲醇配制成1 mL含20 µg的溶液。

2）供试品溶液的配制 精密移取提取液0.25 mL于50 mL容量瓶中，以25%甲醇稀释至刻度，取少量溶液离心（13 000 r/min，10 min）后吸取上清液作为供试品溶液。

3）色谱条件 流动相为甲醇-0.01% KH2PO4（28∶72）；体积流量1.0 mL/min；柱温40 ℃；检测波长250 nm；进样量20 μL。

1.3.3 工艺优化

1）水提工艺的优化 以浸泡时间、加水量、提取时间为考察因素，以丹酚酸B和葛根素含量为评价指标，采用L9（34）正交试验进行水提工艺条件的优选。

2）纯化工艺的优化 取水提液加入95%乙醇，考察不同浓度乙醇及沉淀次数对丹酚酸B、葛根素纯化的影响，并测定其含量加权值，以二成份加权值为主要评价指标。

2 结果

2.1 水提工艺研究

2.1.1 药材浸泡时间的考察

按处方量称取丹参、葛根、女贞子、垂盆草、片姜黄与炒白术药渣（片姜黄，炒白术已提前加热回流提取挥发油），加入其12倍量水，每隔15 min观察药材的浸润程度。结果显示，浸泡0.5 h时，药材基本浸润透，故浸泡时间为0.5 h。

2.1.2 水提工艺条件优选

采用正交试验设计，以第一次提取时间，第二、三次提取时间，加水量为考察因素，每个因素确定3个水平，选取正交表L9（34）（表1、2），以丹酚酸B和葛根素含量为评价指标，对水提工艺进行优选。

表1 因素水平表

表2 正交实验结果

2.1.3 试验结果与分析

根据极差值大小，影响因素顺序为C＞A＞B即加水量＞第一次提取时间＞第二、三次提取时间。方差分析结果显示加水量对加权值有显著性差异（表3），其中水平1的试验指标平均值最大，故加水量为12倍。而第一次提取时间和第二、三次提取时间对其无显著性差异，采用直观分析，根据极差值和试验指标值，选择第一次提取时间为1.5 h，第二、三次提取时间在随机误差范围内，出于节约时间和能源考虑，选择0.5 h。综合考虑，确定最佳工艺条件为A2B1C1，即第一次提取时间为1.5 h，第二、三次提取时间为0.5 h，加水量为药材质量的12倍。

表3 正交试验方差分析

2.1.4 验证

进行3批提取验证试验，结果表明，平均得膏率为29.83%，二成份加权值的平均值为4.21 mg/mL（表4）。其得膏率与二成份加权值正交实验结果基本一致，说明该提取工艺稳定，重现性良好。

表4 验证实验结果

2.2 纯化工艺研究

2.2.1 纯化方式的考察

取水提液32.5 mL，共5份。加入95%乙醇至含乙醇浓度分别为65%，70%，75%，80%，85%，静置过夜，过滤，滤液浓缩至32.5 mL。测定丹酚酸B、葛根素含量，计算加权值。取浓缩液各20 mL真空干燥，计算得膏率。结果表明，得膏率以乙醇浓度85%时最小、70%最大；丹酚酸B、葛根素含量的加权值随着乙醇浓度的升高变化不大。考虑到节约成本，确定沉淀用乙醇浓度为65%（表 5）。

表5 乙醇浓度对丹酚酸B和葛根素提取的影响

2.2.2 乙醇沉淀次数考察

分别测定乙醇沉淀1次、2次、3次备用液中丹酚酸B、葛根素含量，并计算加权值。各取20 ml真空干燥，计算得膏率。结果表明，得膏率随着乙醇沉淀次数的增多而减小；其丹酚酸B、葛根素加权值也随着乙醇沉淀次数的增加而降低。以二成份加权值为主要评价指标，综合分析，确定乙醇沉淀次数为一次（表6）。

表6 乙醇沉淀次数对丹酚酸B和葛根素提取的影响

2.2.3 验证实验

取1倍量处方药材（65 g），按上述方法和最佳工艺条件进行3批提取验证试验，结果表明，用最佳提取工艺进行三份验证试验，其得膏率和加权值均与正交实验结果基本一致，说明该提取工艺稳定，重现性良好。综上所述，确定最佳乙醇沉淀工艺为：用65%乙醇沉淀1次（表7）。

表7 验证实验

3 讨论

本试验采用正交设计对水提和乙醇沉淀纯化工艺进行选择，此试验次数少，效果好。但考虑到实际生产中的成本、可行性、效率等，所以最后确定工艺参数并不一定是目前理论上的最佳选择，往往需要根据实际情况，进行适当调整[8]。

参葛颗粒方由多味药组成，化学成分复杂，含丹酚酸B、异黄酮成分葛根素、糖类等多种成分。本方中脂溶性与水溶性成分都较多[9-10]。其中白术与片姜黄主要有效成分为挥发油，在制剂中易挥发，失去其功用，故在水提工艺前[11]，采用水蒸气蒸馏法对炒白术、片姜黄中的挥发油进行提取[12]，提取后的药渣在水提工艺中和方中所有药味一起提取，过程中不会造成处方中成分的流失，也不影响处方的工艺参数。本试验优选出的参葛颗粒最佳水提和纯化工艺稳定，具有良好的重现性和可操作性，可为实际生产提供参考。