间充质干细胞在组织修复和再生中应用的研究进展

蔡海军 综述，简华刚 审校

(重庆医科大学附属第二医院急诊外科 400010)

再生医学是指利用生物学和工程学的理论方法促进受损组织的修复和再生，使机体恢复正常的组织特征与功能。细胞和基因治疗与组织工程的结合是目前再生医学的主要研究方向，对彻底治疗疾病和损伤具有巨大的潜力。间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)是一种具有自我更新能力和多向分化潜能的多系细胞，是再生医学治疗领域中应用最广泛的细胞来源，在组织修复愈合和再生中发挥着关键作用[1]。本文就MSCs的功能特性及其在组织修复和再生中的研究进展进行综述。

1 MSCs概述

20世纪60年代，FRIEDENSTEIN等首次从骨髓中分离出MSCs，其为一种非造血干细胞。2006年，国际细胞治疗学会提出了定义MSCs的3个最低标准：(1)MSCs在标准培养条件下具有塑料粘附性；(2)MSCs表达CD105、CD73和CD90，且缺乏造血标志物CD45、CD34、CD14或CD11b、CD79α或CD19和人类白细胞抗原(human leukocyte antigen，HLA)-DR的表达;(3)MSCs在体外具有分化成成骨细胞、脂肪细胞和成软骨细胞的能力[2]。

MSCs丰富的来源是其广泛研究和应用的重要基础，可以从骨髓、牙髓、脂肪、滑膜、脐带、羊膜和胎盘等多种组织中分离和培养。脂肪组织在人体内特别丰富且容易获得，这使它成为最安全、最可靠的干细胞分离场所[3]。人脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells,hUC-MSCs)主要来源于脐带血、沃顿氏胶、血管及其周围组织[4]，被认为比骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BM-MSCs)和脂肪间充质干细胞(adipose-derived mesenchymal stem cells,AD-MSCs)具有更高的增殖和克隆能力。

MSCs具有独特的生物学特性和功能：(1)MSCs具有强大自我更新能力。(2)MSCs具有多向分化潜能，即可塑性。MSCs不仅能分化成各种组织，如骨、软骨、肌肉、脂肪、肌腱、韧带、真皮、椎间盘等[5]，还能分化成非中胚层细胞系，如肝细胞、神经元样细胞和胰腺细胞等。(3)MSCs具有抗炎和免疫调节特性[6]。(4)MSCs具有趋向性和归巢能力[4]，能够向损伤、炎症和肿瘤的部位迁移及定向迁移到特定的组织。(5)MSCs可以表达和分泌多种生物活性因子，包括细胞因子、生长因子和趋化因子，这些细胞因子参与MSCs的旁分泌活动[7]。MSCs的这些特性和功能使其成为再生医学中最有希望的候选者，在组织再生和修复方面得到了广泛的研究。

2 MSCs的多向分化潜能

MSCs具有多向分化潜能，能定向分化成各种组织。MSCs高成骨分化的特性被广泛应用于骨和软骨损伤修复[8]。骨缺损通常伴随着创伤、关节翻修或肿瘤切除手术的恢复，自体骨移植是治疗的金标准，但其存在许多缺点，包括自体骨供应有限、手术时间和出血量增加、供体部位骨结构暂时中断、异体骨移植有排斥反应和(或)感染的风险。因此，以MSCs为基础的骨组织工程被认为是一种有希望和可行的骨结构和功能修复的治疗方法。在坐骨神经损伤模型中，通过局部植入MSCs，可以促进损伤部位神经突和血管的生长，促进靶肌的神经再生[9]。MSCs在减轻心肌损伤中的作用于2002年首次被报道[10]，纯化的BM-MSCs移植到小鼠心肌后可分化为心肌细胞。在体外诱导hUC-MSCs分化为组织工程角膜内皮，移植可以维持角膜厚度和透明度，组织工程角膜内皮可能被用作治疗角膜内皮疾病的异体细胞来源[11]。

3 MSCs的免疫调节能力

MSCs具有固有的免疫调节特性[12]，包括抗炎、免疫调节和免疫抑制能力。MSCs参与先天免疫和适应性免疫，主要通过细胞间接触和分泌细胞因子、免疫细胞如T细胞、B细胞、自然杀伤(natural killer，NK)细胞、巨噬细胞、单核细胞、树突状细胞(dentritic cell，DC)和中性粒细胞相互作用发挥其免疫调节功能[13]。MSCs独特的免疫调节特性使其成为修复慢性炎症、移植物抗宿主病、过敏性疾病等自身免疫性疾病引起的组织/器官损伤的宝贵细胞类型。

自身免疫性疾病与宿主免疫系统、慢性炎症和对自身抗原的免疫反应有关，会导致多个组织的损伤和衰竭。MSCs在自身免疫性疾病(包括类风湿关节炎、多发性硬化症、系统性红斑狼疮、炎症性肠病、自身免疫性肝病和干燥综合征)的治疗中具有积极影响[14]。MSCs能够在受损的心肌组织中建立稳定的炎症微环境，其免疫调节功能可能是治疗心血管疾病的一种新的治疗策略[15]。MSCs可通过抑制促炎因子[如白细胞介素(interleukin，IL)-1β、IL-6、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF)-α、干扰素-γ等]的表达和增加抗炎因子(如IL-10、IL-4、IL-13、IL-35、转化生长因子-β等)的表达发挥免疫调节作用促进周围神经损伤的修复和再生[16]。

4 MSCs的旁分泌能力

4.1 旁分泌因子和条件培养基

目前多项研究表明，在组织修复过程中，移植的MSCs可通过分泌旁分泌因子，即能够分泌有助于组织修复再生的趋化因子、细胞因子和生长因子来促进损伤组织的愈合[17]。hUC-MSCs分泌4种主要因子，即血管生成素、白细胞介素-8、单核细胞趋化蛋白-1和血管内皮生长因子，提高小鼠后肢缺血模型的血管再生能力[18]。hUC-MSCs衍生的内皮细胞的分泌因子中富集5种可溶性蛋白质，即血管生成素-1、血管生成素-2、成纤维细胞因子、基质金属蛋白酶-9和血管内皮生长因子，可以促进2型糖尿病小鼠模型的伤口愈合[19]。

MSCs条件培养基(mesenchymal stem cell-conditioned media,MSC-CM)也被用于组织修复，MSC-CM中含有MSCs分泌的细胞因子，MSC-CM的使用成为干细胞治疗中一种无细胞治疗方法。研究发现，人脐带MSC-CM中含有许多与皮肤再生相关的旁分泌因子，如上皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、血小板衍生生长因子、肝细胞生长因子、Ⅰ型胶原，特别是其中一种再生因子，即生长分化因子-11通过刺激人真皮成纤维细胞的生长和细胞外基质的产生来诱导皮肤伤口愈合[20]。骨髓MSC-CM可以保护H9c2心肌细胞免受缺氧/复氧诱导的损伤，其机制是通过调节Notch2/mTOR/自噬信号通路介导的，为治疗心肌缺血/再灌注损伤及其他缺血性疾病提供了新的见解[21]。

4.2 外泌体

外泌体由MSCs通过旁分泌信号通路分泌，由内溶酶体微粒内陷或向内出芽形成多泡体，随后多泡体外膜与细胞膜融合而产生[22]。外泌体分布广泛，存在于各种体液中，如血液、尿液、唾液、脑脊液、乳汁和汗液[7]。外泌体是具有脂质双层膜的纳米级细胞外囊泡，在显微镜下呈杯状结构，直径为30～120 nm，密度为1.13～1.19 g/mL，包含脂质、蛋白质和核酸，如DNA、mRNA、非编码RNA[包括微RNA(microRNA，miRNA)和长链非编码RNA(long noncoding RNA，LncRNA)]等[22]，表达特异膜蛋白CD9、CD63和CD81等。外泌体是促进细胞间通信的重要介质，不需要细胞与细胞直接接触，且具有靶向传递、低免疫原性和高修复性的优点，在组织修复和再生中具有关键作用，外泌体已经成为再生医学发展新方向。

外泌体通过其包含的蛋白质、脂质、核酸和其他生物活性分子在MSCs及其靶细胞之间相互转移发挥作用。源自硬膜外脂肪间充质干细胞(epidural fat mesenchymal stem cells,EF-MSCs)的外泌体可以改善大鼠脊髓损伤后的神经功能恢复，其潜在的分子机制与抑制NLRP3炎性小体激活，降低促炎因子IL-1β、IL-18和TNF-α的表达，减少神经元凋亡有关[23]。嗅鞘细胞有利于神经再生，但受缺氧环境的限制，hUC-MSCs来源的外泌体可调节缺氧引起的病理损伤，嗅鞘细胞和外泌体联合可以促进坐骨神经再生和功能恢复[24]。hUC-MSCs衍生的外泌体可通过减少氧化应激和炎性反应来调节内皮细胞功能，从而促进血管生成并最终加速糖尿病伤口的愈合[25]。MSCs衍生的细胞外囊泡可以抑制辅助型T细胞(helper T cell，Th)1、Th17和M1巨噬细胞等多种促炎细胞的活化和增殖，减少促炎细胞因子(IL-1β、IL-6)的分泌，同时促进M2巨噬细胞和调节型T细胞等抗炎细胞的增殖，增加抗炎细胞因子(转化生长因子-β、IL-10)的分泌，发挥免疫调节作用，改善肝脏炎症，从而缓解不同种类的肝脏疾病，包括非酒精性脂肪肝、自身免疫性肝炎、急性肝衰竭、肝纤维化和肝缺血再灌注损伤等[26]。

外泌体中的LncRNA在组织修复与损伤中的作用在越来越多的研究中被发现。miRNA被认为是一种长度约为22个核苷酸的非编码RNA，是主要的外泌体效应分子之一，可调控基因表达，参与多种生理病理过程，包括细胞分化、凋亡、血管生成和炎症通路。研究发现，在具有施旺细胞表型分化的AD-MSCs分泌的外泌体中发现了更多的miRNA，如miR-132-3p和miR-199b-5p，与神经保护、抗炎和血管生成高度相关，能下调M1巨噬细胞的促炎基因表达和细胞因子分泌，保护大鼠施旺细胞免受氧化应激，并促进人脐静脉血管内皮细胞迁移和血管生成，以及诱导多能干细胞分化的感觉神经元轴突生长，增强神经再生[27]。hUC-MSCs衍生外泌体中的miR-140-3p可沉默糖皮质激素诱导激酶1，抑制炎症、氧化应激和纤维化，减轻类风湿性关节炎大鼠的关节损伤[28]。外泌体中的LncRNA在组织修复与损伤中也发挥重要的作用。来自经巨噬细胞迁移抑制因子预处理的MSCs的外泌体通过转移LncRNA-NEAT1抑制miR-221-3p，并导致Sirt2激活，在阿霉素诱导的心肌病中恢复心功能并发挥抗衰老作用[29]。AD-MSCs在缺氧条件下分泌的外泌体中LncGm37494表达增加，通过抑制miR-130b-3p和促进过氧化物酶体增殖物激活受体γ的表达，加速了小胶质细胞M1/M2的极化，抑制炎症因子表达，促使功能恢复，有效修复脊髓损伤[30]。

5 MSCs的临床应用

目前在Clinicaltrials.gov上已经列出了超过1 000项关于“MSCs”的临床试验研究，MSCs治疗的疾病包括自身免疫性疾病(如炎症性肠病、1型糖尿病)、移植物抗宿主病、骨科疾病(如膝关节炎、退行性椎间盘疾病)、心肌病、肺部疾病(如急性呼吸窘迫综合征、慢性阻塞性肺疾病)、急慢性创面修复(如烧伤、糖尿病足)、神经退行性疾病(如帕金森病)等，MSCs的临床研究正在快速发展。在一项前瞻性、单盲、随机对照的初步研究中，15例膝骨关节炎患者经关节内注射自体骨髓浓缩液和富血小板血浆治疗12个月后，疼痛减轻、运动功能及与膝关节相关的生活质量明显改善[31]。一项人体试验首次在9例慢性静脉性溃疡患者的12处创面使用ABCB5+真皮MSCs进行局部治疗，12周时创面中位尺寸缩小63%，疼痛感减轻，治疗具有良好的耐受性和安全性[32]。ZANG等[33]进行了一项前瞻性、单中心、随机、双盲、安慰剂对照的Ⅱ期临床试验，对45例2型糖尿病患者静脉输注hUC-MSCs，结果显示减少了患者对外源性胰岛素的需求，缓解了胰岛素抵抗，说明hUC-MSCs移植可能是2型糖尿病潜在的治疗选择。在一项Ⅰ～Ⅱ期随机临床试验中，为了评估BM-MSCs对急性-慢性肝衰竭(acute-on-chronic liver failure,ACLF)2级和3级患者的初始疗效和安全性，结果显示完成整个MSCs输注方案的患者Child-Pugh评分、终末期肝病模型(model for end-stage liver disease，MELD)评分和ACLF评分均有明显改善[34]。在另一项临床试验中，对10例子宫损伤后愈合不良的患者(6例宫内粘连、4例剖宫产疤痕憩室)进行宫内注射临床级的hUC-MSCs治疗，结果显示治疗安全，对于子宫损伤后愈合不良的患者，干细胞移植可能是一种有前途的治疗方法[35]。ZHU等[36]为了评估从AD-MSCs中提取的外泌体雾化吸入治疗新型冠状病毒感染患者的安全性，将7例感染患者连续5 d吸入临床级外泌体高达2.0×109纳米囊泡的剂量，结果表明方法可行，且患者耐受性良好，为以MSCs为基础治疗急性呼吸道疾病提供了依据。

6 总结与展望

MSCs目前依然是再生医学研究的热点，自我更新能力、多向分化潜能、免疫调节能力、旁分泌因子及外泌体等决定了其在组织修复与再生中的广泛应用与无限潜力。此外，合适的诱导因子，如缺氧预处理[37]、物理刺激[38]、基因修饰及具有生物相容性的可降解支架[39]等可以促进MSCs发挥功能。同时，MSCs和外泌体也可以作为一种天然的生物活性物质或药物的靶向递送载体[22,40]。当然，也存在一些问题，MSCs及外泌体在体内如何发挥作用(生物分布、生物利用度、靶向性、药代动力学等)及如何准确给药(给药途径、剂量、间隔、效力测定等)需要进一步的研究。MSCs的培养及外泌体的分离纯化，选择合适的支架和诱导因子对MSCs治疗至关重要。MSCs及外泌体的保存、运输和储存至关重要。细胞产品临床应用的安全性、副作用的未知性应该得到密切关注。尽管目前存在诸多挑战，但以MSCs为基础的组织工程依然代表了未来再生医学治疗领域的发展方向。