药物中磺酸酯类基因毒性杂质测定方法研究进展

韩佳芮，徐艳梅，郝丽娟，高燕霞

（1.河北科技大学，石家庄 050091；2.河北省药品医疗器械检验研究院，石家庄 050200）

药物在生产制备过程中会产生或者引入杂质，这些杂质会严重影响人们的身体健康，因此，药品的安全性不仅取决于活性原料药的毒理学特性，还取决于其所含杂质。近年来，药物中基因毒性杂质(GTI)是一个热门话题，基因毒性杂质是指痕量就能直接或间接损伤细胞DNA、引起基因突变、染色体断裂或染色体重排的杂质[1]。

磺酸酯为磺酸的有机酯，含有R—SO2O—官能团。磺酸酯类化合物是潜在的基因毒性杂质，在药物生产过程中很容易引入，因为苯磺酸盐等起始原料中含有磺酸酯类杂质；在药物合成中间体或者副产物中会产生磺酸酯类杂质；在清洗仪器时使用低级醇或以低级醇为溶剂，与磺酸类化合物等发生化学反应也会生成磺酸酯类杂质[2‒4]。磺酸酯类杂质在经过体内代谢后毒性极强，在药物研发和生产过程中应该严格控制。国际癌症研究机构(IARC)于1987 年将甲基磺酸乙酯(EMS)列入致癌物清单，归为2B 类致癌物，1999 年将甲基磺酸甲酯(MMS)列入致癌物清单，归为2A类致癌物[5]。

2007年，甲磺酸奈非那韦药物中基因毒性杂质甲磺酸乙酯超标，甲磺酸乙酯超标的原因是用乙醇清洗原料药储存罐时，乙醇没有烘干，残留下来的乙醇与原料药中的甲基磺酸发生反应，生成甲基磺酸乙酯，被患者摄入体内会严重影响到患者的身体健康[2]。甲磺酸奈非那韦事件引起国内外制药企业和监管部门对磺酸酯类基因毒性杂质的广泛关注。2008 年，欧洲药物管理局(EMA)和美国食品药品管理局(FDA)引入了毒理学关注阈值(TTC)，即可接受风险摄入量，把1.5 μg/d 作为基因毒性杂质的最大摄取量[6‒7]，用来作为限制药物研发和生产过程中引入的基因毒性杂质的标准。

测定痕量水平的基因毒性杂质，需要高灵敏度和高选择性的分析方法，这给药物研发和分析带来了巨大的挑战[8]。目前磺酸酯类基因毒性杂质的测定方法主要有高效液相色谱(HPLC)法、液相色谱-质谱联用(LC-MS)法、气相色谱(GC)法和气相色谱-质谱联用(GC-MS)法。

1 高效液相色谱法

高效液相色谱法能够在短时间内对复杂样品进行分离，是药物分析中最经典、最常用的方法，广泛应用于医学药物、食品、环境、农业等各个方面，具有快速、高效、高灵敏度等特点[9‒10]。高效液相色谱法在检测机构和制药企业的日常药品检测中具有适用性，值得广泛推广应用。

焦洁等[11]建立了HPLC法测定注射用长春西汀中对甲苯磺酸甲酯和对甲苯磺酸乙酯含量的方法，对流动相和色谱柱进行考察，选择Waters ODS2 C18色谱柱，可以很好地避免样品峰拖尾对待测组分的干扰，提高了检测的灵敏度。结果显示，2种基因毒性杂质均具有良好的线性关系，准确度好，检出限分别为0.015、0.023 μg/mL。王建等[12]建立了HPLC法测定更昔洛韦缩合物中基因毒性杂质，对检测波长、缓冲溶液、流动相、流速、色谱柱进行了考察，测定对甲苯磺酸甲酯和对甲苯磺酸乙酯的含量，线性关系良好，检出限分别为15.852、15.848 ng/mL。孙朴等[13]建立了液相色谱-紫外法测定氢溴酸西酞普兰中的基因毒性杂质对甲苯磺酸乙酯，线性关系良好，精密度良好，定量限和检出限分别为0.025 6、0.012 4 μg/mL。江凡等[14]采用HPLC法测定布林佐胺中基因毒性杂质，对缓冲液和流动相进行了考察，选择磷酸-水体系作为流动相，用三乙胺调节pH 值，可以减少流动相对仪器和色谱柱的损伤，同时使杂质能够很好地分离，对甲苯磺酸异丙酯检出限为0.008 5 μg/mL，专属性良好，线性关系良好。谢卫锋等[15]建立了测定托吡司特中基因毒性杂质的高效液相色谱法，优化了流动相和最大吸收波长。测定结果表明，对甲苯磺酸异丙酯、对甲苯磺酸仲丁酯、对甲苯磺酸乙酯三种基因毒性杂质线性关系良好，检出限分别为0.016 7、0.015 8 和0.016 8 μg/mL。舒理建等[16]建立了HPLC 法测定苯磺贝他斯汀片中基因毒性杂质，对色谱柱进行考察，选用ACE 3 C8色谱柱，苯磺酸乙酯与苯磺酸异丙酯分离效果好，线性关系良好，检出限分别为0.000 032、0.000 064 mg/mL。

高效液相色谱法操作简单，灵敏度高，专属性强，准确可靠，在很大程度上节省了检测成本和检测时间，用于磺酸酯类基因毒性杂质的测定具有很好的应用价值。

2 液相色谱-质谱联用法

液相色谱-质谱联用法是把液相色谱和质谱结合在一起使用。液相色谱作为分离系统，在对药品进行化学分析测定时，样品首先在液相色谱中初步分离，然后在质谱中再次分离，通过离子化把离子碎片按质量数分开；质谱作为检测系统，通过质谱检测得到质谱图。把液相色谱与质谱技术相结合，解决了被液相色谱分离的组分的定性问题及质谱样品需预处理、程序复杂、耗时长的问题，充分发挥两者的综合优势。近年来，LC-MS 技术越来越完善，在药物分析、环境监控、食品成分检测等方面得到了广泛的应用[17‒18]。

基因毒性杂质含量极低，且种类较多，导致分离检测较为困难，高效液相色谱法难以准确测定。液相色谱-质谱法具有高选择性、高灵敏度的特点，LC-MS 法是药物分析检测的高效和切实可行的技术手段，在基因毒性杂质研究中已有很多报道。黄伟民等[19]对质谱、溶剂、流动相等条件进行了考察，采用气相色谱-质谱联用法测定樟脑磺酸酯类的基因毒性杂质，难以满足检测要求，因此，建立LC-MS法测定硫酸氢氯吡格雷原料药中基因毒性杂质左旋樟脑磺酸甲酯和左旋樟脑磺酸异丙酯，线性关系良好，两者检出限均为1.67 ng/mL，定量限均为5.00 ng/mL。曹丽晓等[20]建立了LC-MS 法对新型VMAT2 抑制剂LPM3770164 中的基因毒性杂质进行定量检测，对分析方法、色谱条件和质谱条件分别进行考察，测定樟脑磺酸甲酯(MCS)、樟脑磺酸乙酯(ECS)的含量，结果线性关系良好，灵敏度高。宋太发等[21]选择Agilent Poroshell 120 EC-C18色谱柱，采用ESI 离子源，正离子模式采集，多反应离子检测，建立LC-MS/MS法测定加替沙星中基因毒性杂质，对甲基苯磺酸乙酯线性关系良好，检出限和定量限分别为0.000 74 ng和0.000 93 ng。骆美玉等[22]选用Waters XTerra RP18色谱柱，以甲醇-水为流动相，采用APCI 离子源，负离子模式检测，建立LC-MS/MS法检测盐酸吉西他滨中基因毒性杂质，甲磺酸甲酯和甲磺酸乙酯质量浓度在20～200 μg/L 范围内与色谱峰面积线性关系良好，检出限和定量限均别为4、10 μg/L。舒诗会等[23]建立LC-MS/MS 法对拉科酰胺原料中基因毒性杂质进行检测，对质谱条件进行优化，选择[M+NH4]+(m/z204.0)作为母离子，采用MRM模式，对流动相和稀释剂进行优化，解决了离子响应不稳定和回收率偏低的问题，结果显示对甲苯磺酸甲酯线性关系良好，定量限为2.62 ng/mL。石小娜等[24]建立LC-MS/MS 法测定盐酸法舒地尔中两种基因毒性杂质5-异喹啉磺酸甲酯和5-异喹啉磺酸乙酯，对溶剂进行了考察，选用50%的乙腈-水溶液作为稀释液，实验结果表明两种基因毒性杂质线性关系良好，检出限分别为0.2 ng/mL 和0.02 ng/mL。Jin等[25]建立HPLC-APCI-MS/MS法测定药物中15 种磺酸酯类杂质，在MRM 模式下利用大气压化学电离对杂质定量，不需要衍生反应，能够在一次HPLC 运行中同时测定15 种基因毒性杂质，该方法检测快速、准确、灵敏。Zhou等[26]建立衍生-高效液相色谱-紫外法测定甲磺酸中甲磺酸甲酯和甲磺酸乙酯的含量，对衍生反应进行优化，以二乙基二硫代氨基甲酸钠(DDTC)作为衍生试剂，溶剂为含有少量NaOH 的二甲基乙酰胺(DMA)，该方法线性关系良好。

随着液相色谱-质谱联用技术的广泛应用，推动了接口技术不断发展优化，出现了四极杆质谱仪、四极杆离子阱质谱仪等多种类型的质谱检测器。四极杆-静电场轨道阱(Q-Orbitrap)质谱是将四极杆-静电场轨道阱结合，是近年来发展起来的高灵敏度、高分辨率、高质量精度的质谱技术之一[27‒28]。刘暘等[29]建立高效液相色谱-四极杆-静电场轨道阱法对盐酸法舒地尔中的基因毒性杂质5-异喹啉磺酸甲酯和5-异喹啉磺酸乙酯进行测定，对质谱质量分析器进行了考察，选用Q-Orbitrap高分辨质谱仪，同时对质谱条件和色谱条件进行优化，采用ESI离子源，正离子模式，在流动相中加入甲酸，加强对化合物的电离，改善色谱峰形。结果显示，两种基因毒性杂质的线性关系良好，检出限分别为0.66、0.30 µg/g，定量限分别为2.0、1.0 µg/g。该方法简便、快速、专属性好、灵敏度高，可用于盐酸法舒地尔的检测。液相色谱-串联四级杆质谱(LC-QQQ-MS/MS)法广泛应用于痕量物质的分析测试，具有灵敏度高、准度高、特异性高等特点。曹琳等[30]建立液相色谱-串联四级杆质谱法测定苯磺酸氨氯地平中基因毒性杂质，对流动相和离子源进行考察，选择了质谱兼容的流动相，采用ESI源，测定苯磺酸甲酯、苯磺酸乙酯、苯磺酸丙酯和苯磺酸异丙酯的含量，四种杂质在1～1 000 ng/mL范围内线性关系良好，苯磺酸甲酯定量限为20 ng/mL，其它三种基因毒性杂质定量限为1 ng/mL，方法灵敏度高、准确度和精密度良好。

3 气相色谱法

气相色谱是一种以气体作为流动相的色谱法，广泛应用于易分离气体和易挥发的成分，灵敏度高，专属性强，芳基磺酸酯类基因毒性杂质大多为难挥发性杂质或不挥发杂质，气相色谱多用于测定烷基磺酸酯类基因毒性杂质[31]。

郑飞等[32]建立了GC 法测定沙格列汀原料药中基因毒性杂质，对气相色谱条件进行选择和优化，采用毛细管气相色谱法测定，检测器为氢火焰离子化检测器，选择甲醇为溶剂，可以很好地达到分离效果；采用直接进样法进行检测，测定甲磺酸甲酯、甲磺酸乙酯和甲磺酸异丙酯的含量，结果显示，线性关系良好，该法操作方便快捷，结果准确可靠。侯奇伟等[33]建立衍生GC法同时检测草酸艾司西酞普兰中甲磺酸甲酯、甲磺酸乙酯和甲磺酸异丙酯三种甲磺酸烷基酯，以NaI-H2O作为碘化衍生试剂，采用氢火焰离子化(FID)检测器，顶空进样，在衍生化过程中，样品与碘化钠也发生衍生化反应，干扰检测，以乙腈为溶剂，三种甲磺酸烷基酯线性关系良好，准确度好。但是，甲磺酸酯类基因毒性杂质性质不稳定，单纯采用GC 法检测分析结果不够准确，难以满足对甲磺酸酯类杂质的痕量检测。

4 气相色谱-质谱联用法

气相色谱-质谱联用法适用于易挥发、半挥发化合物的分析，把气相色谱作为质谱的进样器，样品在气相色谱柱中分离，把质谱作为检测器，样品分离以后在质谱仪中进行分析检测，能准确地分析复杂混合物[34‒36]。气相色谱与质谱联用弥补了气相色谱对未知化合物定性能力差的缺点，利用分析速度快、灵敏度高、准确度好的质谱作为检测器，广泛应用于科学研究、工业生产、药品、食品等领域的检测[37‒38]。

包小红等[39]采用三重四级杆质谱检测器，以DB-5MS 毛细管柱为色谱柱，流速是恒线速度控制模式，不分流进样，样品无须预处理，建立GC-MS/MS 法对泊沙康唑中基因毒性杂质对甲苯磺酸甲酯、对甲苯磺酸异丙酯、BS-1中间体-2和BS-1中间体-3 残留量进行测定，4 种基因毒性杂质的线性关系良好。但由于样品存在大量非挥发性基质，会造成气相进样口污染，因此需要合适的预处理减少基质的干扰。许多研究人员采用衍生化的方式，将磺酸酯衍生为较为稳定的、挥发性的物质。姚彤等[40]建立了GC-MS/MS 法测定盐酸吉西他滨中2 种甲磺酸酯类基因毒性杂质甲磺酸甲酯和甲磺酸乙酯，以碘化钠为衍生试剂，对色谱柱进行考察，采用背景噪音低的VF-WAX ms 毛细管色谱柱，对内标物进行考察，以甲磺酸正丁酯作为内标物，两种磺酸酯类杂质线性关系良好。与LC-MS/MS 法相比，GCMS/MS 专属性好、灵敏度高，更适于盐酸吉西他滨中基因毒性杂质的检测。Zhang 等[41]提出了GCMS 法同时测定甲磺酸伊马替尼中基因毒性杂质，采用萃取离子色谱法定量甲磺酸甲酯和甲磺酸乙酯，线性关系良好。在进样前采用在线柱前衍生法，减少了基质干扰，与直接进样相比，大大提高了灵敏度。董海峰等[42]建立的顶空-GC-MS 法，分别对色谱柱、柱流量和进样时间进行了优化，选择了最优的色谱条件，在顶空瓶内衍生，检测苯磺酸左旋氨氯地平片中3种苯磺酸酯类基因毒性杂质苯磺酸甲酯，苯磺酸乙酯和苯磺酸异丙酯，结果显示三种杂质线性关系良好，检出限为0.03～0.13 mg/kg，定量限为0.14～0.25 mg/kg。李炎等[43]建立在线衍生顶空进样GC-MS法测定沙芬酰胺原料药中基因毒性杂质甲磺酸甲酯、甲磺酸乙酯、甲磺酸异丙酯、甲磺酸丙酯和甲磺酸丁酯，对方法的耐用性进行考察，耐用性良好，5种基因毒性杂质线性关系良好，检出限为0.3～1.3 ng/mL，定量限为0.9～4.3 ng/mL。高洁等[44]同样建立了顶空HS-20 GC-MS 联用法，检测甲磺酸盐类原料药中甲磺酸甲酯、甲磺酸乙酯、甲磺酸异丙酯与甲磺酸丙酯四种甲磺酸烷基酯杂质，四种杂质线性关系良好，检出限在0.01～0.10 ng 之间。气相色谱-质谱联用法灵敏度高，准确可靠，在测定磺酸酯类基因毒性杂质中的应用将会更加广泛。

5 结语

在原料药的合成过程中，需要使用大量的起始原料、工艺中间体和试剂才能得到最终原料药，其中一些物质、中间体和试剂，以及合成过程的副产物，都有可能产生基因毒性杂质，并以低水平的杂质存在于活性成分或最终药品中，对人们的健康造成很大的危害。对痕量基因毒性杂质进行检测和分析，不仅对仪器的要求很高，而且对分析方法的特异性要求也很高。随着研究的深入，将会有更加高效便捷的检验技术和方法应用于磺酸酯类杂质的检测，逐步实现药物中磺酸酯类基因毒性杂质的精准检测和有效控制，为药物的安全性提供了必要的技术支持，以保障人民的用药安全。