敲除TSP1通过氨基酸和糖代谢通路对阿霉素所致心肌损伤的作用*

占敏, 卓丰, 吴敏, 李科浩, 张守华, 杨豆

江西省儿童医院 1普外科， 2心脏病中心(江西南昌 330038)； 3南昌大学药学院(江西南昌 330006)

阿霉素(adriamycin, ADM)是一种含醌的蒽环类药物，广泛用于治疗实体和血液系统恶性肿瘤，但其严重不良反应的心脏毒性导致临床上应用受制约。ADM所致心脏毒性呈剂量依赖性，可导致心肌细胞丢失、线粒体功能障碍、肌原纤维变性和预后不良的充血性心功能衰竭[1]。血小板反应蛋白1(thrombospondins-1, TSP1)是细胞外基质中的基质细胞蛋白，在各种心血管疾病的病理过程中起着重要作用。TSP-1通过直接或间接与配体相互作用来调节其结构和活性，从而调节不同类型细胞对环境刺激的反应活性。许多心血管疾病的病理过程都与细胞外基质成分的降解和重塑以及细胞迁移、功能障碍和凋亡有关，这可能通过不同的机制受到TSP-1的调节[2]。TSP-1在多种心血管疾病的病理过程中起着重要作用，可能为在分子水平上治疗不同的心血管疾病提供新的靶点，特别是TSP1在心脏病中的作用仍然是正在进行的研究的重点。代谢组学是一门继基因组学、蛋白质组学和转录组学后的新兴学科，它通过检测样本中的小分子化合物及多变量分析，发现和确定与病理相关的差异代谢物。对于心脏疾病中TSP1相关基因的表达情况已有相关研究，但是至今未见其调控小分子代谢物方面的研究报道。2020年10月至2022年1月，本研究以野生型C57BL/6和TSP1基因敲除后的小鼠(TSP1-/-)为实验对象，对比ADM所致的心肌损伤小鼠体内代谢物的变化情况，探讨TSP1敲除减弱ADM造成的心肌损伤的代谢机制。

1 材料与方法

1.1 实验模型 C57BL/6小鼠购自湖南斯莱克生物技术有限公司。TSP1-/-小鼠由C57BL/6背景产生，购自Jackson实验室。ADM购自瀚晖制药。所有研究均经江西省儿童医院伦理委员会批准(JXSETYY-YXKY-20220162)。24只野生型C57BL/6和24只TSP1-/-小鼠(20～25 g)分为4组：WM组(n=12)、TSP1-/-组(n=12)和WM-ADM组(n=12)、TSP1-/--ADM组(n=12)。WM组和TSP1-/-组小鼠腹腔注射生理盐水，WM-ADM组和TSP1-/--ADM组小鼠腹腔注射ADM以建立慢性心功能衰竭(CHF)模型，直至ADM累计剂量达15 mg/kg(2.5 mg/kg，溶于生理盐水中，每3 d 1次，共6次)。注射ADM后常规喂养，观察和记录小鼠体重情况，最后一次给药后3 d处死小鼠[1]，收集血液和心脏。血液样本静置1 h后3 000g离心10 min以采集血清，并储存在-80℃。心脏用生理盐水冲洗干净，中性甲醛溶液溶液固定用于病理分析，剩余部分-80℃保存。

1.2 血液生化检测 肌酸激酶(creatine kinase，CK)、肌酸激酶同工酶(creatine kinase isoenzymes，CK-MB)、乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase，LDH)试剂盒购自南京建成生物工程研究所。

1.3 组织学分析 心脏组织在甲醛溶液固定后，常规切片(4 μm)进行常规苏木精和伊红染色，观察组织形态变化。

1.41HNMR检测样本处理 取WM组小鼠、TSP1-/-组小鼠、WM-ADM组和TSP1-/--ADM组小鼠对应的血清各12例用于1HNMR检测。4℃解冻血清样本，取血清200.0 μL加入800.0 μL甲醇，混匀后12 000g离心5 min，取上清液800.0 μL使用旋转蒸发仪于35℃下挥发干溶剂以得到浓缩样本。加入550 μL氘代甲醇复溶，涡旋混匀，超声5 min，于12 000 r/min离心5min，取上清液550 μL移入5 mm核磁管。NMR谱采样前，将样本置于4℃冰箱中保存备用[3-5]。

每个1H NMR光谱强度数据集被归一化为整个光谱的总谱强度。归一化后数据导入SIMCA-P (version 14.1)，采用UV标度化预处理后进行多元统计分析如主成分分析(principal component analysis，PCA)、偏最小二乘判别分析(partial least squares discriminant analysis，PLS-DA)和正交偏最小二乘判别分析法(orthogonal partial least-squares discrimination analysis, OPLS-DA)[6]。通过OPLS-DA其载荷图和变量重要性(variance importance, VIP)数据获得引起分类差异的特征变量[7]。通过将其化学位移和耦合模式与相应值进行比较，在1H NMR光谱中确定了代谢物[8]。

通过将1H-NMR光谱中的代谢物的化学位移和耦合方式与文献和公开的可访问数据库(http://www.bmrb.wisc.edu, http://www.hmdb.ca)中参数进行对比，以鉴定出代谢物。对上述已鉴别的特征核磁峰在一定的区域内进行积分，并对其在TSP 1-/-和WM两组的平均值是否存在差异进行独立样本T检验 (SPSS 23.0)。 将具有显著性差异的代谢物导入在线的MetaboAnalyst分析软件，对其中所涉及的代谢通路进行富集分析。

2 结果

2.1 敲除TSP1对ADM致急性心功能衰竭小鼠心肌酶的作用 注射ADM后WM-ADM组小鼠CK、CK-MB、LDH均明显升高，分别是(1.86±0.16)U/mL、(159.68±12.37) U/mL以及(7 257.76±430.83) U/L，与WM组差异有统计学意义(P<0.05)。而TSP1-/--ADM组小鼠CK、CK-MB相比WM-ADM组显著降低(P<0.05)，分别为(1.46±0.12)U/mL及(128.84±8.30)U/mL；LDH为(6 848.49±282.92)U/L，LDH差异无统计学意义(P>0.05)，见图1。

注：*P<0.05

2.2 敲除TSP1对急性心功能衰竭小鼠心肌损伤的改善作用 心肌组织HE染色显示，WM组小鼠心肌纤维排列平行，胞核清晰，未见胞体水肿，组织间隙正常。WM-ADM组心肌组织受损，纤维中断，排列错综交叉无规律，部分心肌细胞水肿和呈空泡样变性，心肌纤维断裂，呈小灶状或片状坏死;心肌细胞间隙明显增宽。与WM-ADM组相比，TSP1-/--ADM组心肌组织受损程度明显减轻(图2)。

2.31H NMR 数据的聚类分析 我们以基于1H NMR的非靶标代谢组学方法对WM小鼠、TSP1-/-小鼠、WM-ADM小鼠和TSP1-/--ADM小鼠血清进行分析。WM组、WM-ADM组和TSP1-/--ADM组小鼠血清样本的1H NMR一维图谱如图3所示，三组间的1H NMR谱存在共同的物质峰，同时观察到在某些化学位移处的波峰大小有明显差异。

将归一化后1H NMR数据导入SIMCA-P软件行多变量分析，四组小鼠血清PCA 得分图和OPLS-DA得分图如图4所示。经PCA后前两个主成分能大致的反映数据集所包含的信息(累积方差>60%)，从该图可以看出各组样品基本聚集在一区域，TSP1-/-和WM-ADM组均远离WM，说明各组血清的代谢表型具有差异。

OPLS-DA模型拟合的质量通常用R2Y (cum)和Q2(cum)两个参数评估，R2Y(cum)表示模型的解释力，Q2(cum)表示模型的预测能力，一般情况下, R2Y(cum)和Q2(cum)>0.5时,说明模型较好[9]。本研究所建立四组小鼠组血清OPLS-DA模型中R2Y=0.961，Q2=0.615，表明OPLS-DA模型均可行。同时，为避免所得结果具有偶然性，并检验该模型的重现性是否良好和数据是否过拟合，我们通过200次7倍交叉检验及置换检验来考查该模型的有效性。以Q2回归线与轴的截距值作为衡量模型是否过拟合的标准，当Q2的截距为负值时,模型有效[10]。结果显示，四组小鼠组血清样本模型中Q2=-0.265，表明OPLD-DA模型有效。综上，我们确定所建立的OPLS-DA模型可用于筛选WM小鼠和TSP1-/-小鼠、WM-ADM小鼠和TSP1-/--ADM小鼠血清中的差异代谢物。

2.4 WM，TSP1-/-，WM-ADM，TSP1-/--ADM小鼠差异代谢物的筛选与鉴定 我们以基于OPLS-DA模型的VIP值为筛选标准，一般而言，VIP值>1.0的变量对模型的聚类有贡献[11-12]。本研究以VIP>1.0为标准，在四组小鼠血清筛选和鉴定出了16种代谢物，其中血清代谢物结果见表1。我们发现与WM组小鼠相比，TSP1-/-组小鼠多种氨基酸类物质受到影响，同时发现WM-ADM组小鼠血清亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、乳酸、丙氨酸、乙酸、丙酮酸共7种代谢物差异有统计学意义(P<0.05)。相比WM组，WM-ADM组亮氨酸、丙酮酸水平分别下调至6.79±0.82、15.94±0.51，乳酸水平上升至3.76±0.05；而在TSP1-/--ADM组小鼠血清如亮氨酸、异亮氨酸、丙酮酸具有明显的回调ADM造成的下降，分别回调到7.86±0.36、22.74±0.93、16.13±0.50，乳酸下降到3.51±0.07。 代谢通路分析也进一步验证了WM-ADM与TSP1-/--ADM小鼠血清氨基酸和糖代谢通路受到明显影响(图5)。

3 讨论

心功能衰竭是临床常见的危重症之一，是多种心血管疾病的末期表现。阿霉素是一种有效的肿瘤化疗药物，具有明显的心脏毒性，可引起心肌炎及心功能衰竭。本实验通过在野生型和TSP1-/-小鼠腹腔注射阿霉素建立了CHF模型。

TSP1介导的信号通路在心脏疾病中有着重要作用，有研究表明，衰竭心脏中TSP1的表达降低，这可能与心室扩张有关[13-14]。用激活cd47的TSP1衍生肽治疗心肌细胞会导致心肌细胞肥大，这表明TSP-1可能导致左心室肥大和心功能衰竭[15]。通过对血清中CK、CK-MB、LDH等指标和心脏组织HE染色分析，我们亦发现TSP1-/--ADM组小鼠心脏损伤显著减轻。为进一步研究TSP1敲除后减弱ADM所致心脏损伤的机制，我们从代谢组学的角度来分析其可能的原因。

本研究中，我们利用基于1HNMR的代谢组学方法对未注射ADM的野生小鼠和TSP1-/-小鼠的血清中的差异代谢物进行筛选，发现敲除TSP1后，小鼠体内多种氨基酸代谢类物质代谢明显不同。对注射ADM后WM小鼠研究分析，我们发现ADM会影响小鼠体内的氨基酸和糖代谢，并且注射ADM后TSP1-/-小鼠体内的氨基酸和糖代谢影响程度显著低于野生型小鼠。由此，我们推断敲除TSP1可能通过调节氨基酸和糖代谢来减弱ADM造成的心肌损伤。

图3 WM组、WM-ADM组和TSP1-/--ADM组小鼠血清1H NMR图谱比较

注：A：血清PCA评分图；B：血清PLS-DA评分图；C：血清OPLS-DA评分图；D：200次交叉验证图

表1 各组血清代谢物的统计学分析结果

注：a：丙酮酸代谢；b：糖酵解/糖异生；c：柠檬酸盐循环；d：缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸生物合成；e：氨基酰基-tRNA生物合成

心脏代谢主要分为3个部分,细胞膜吸收和胞质激活,线粒体氧化和进入三羧酸循环(TCA),最终通过电子链和ATP合成酶进行电子转移和氧化还原合成ATP。为了维持ATP的产生,心脏可以代谢一系列底物,包括脂肪酸、糖、酮体、乳酸和氨基酸。研究发现心功能衰竭时,脂肪酸的摄取和氧化降低,葡萄糖代谢增加。心肌梗死和心功能衰竭时可以导致如支链氨基酸(亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸)(BCAA),牛磺酸或谷氨酰胺等氨基酸代谢的异常[16-18]。亮氨酸的辅酶衍生物还可继续参与支链脂肪酸的合成。本研究WM-ADM小鼠血清中亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸含量与WM小鼠相比具有显著差异，说明支链氨基酸代谢发生紊乱。而在TSP1-/--ADM组小鼠血清中相关氨基酸含量变化程度低于WM组小鼠。由此，我们认为ADM会显著影响小鼠体内的氨基酸代谢，加重心肌组织的损伤。而TSP1-/-组小鼠可能通过维持其心脏中氨基酸代谢的平衡，最终减弱ADM造成的心肌损伤。

心血管疾病的发展过程主要受糖脂代谢因素的影响，糖脂代谢紊乱是多重代谢紊乱的核心。糖代谢异常包括乳酸、丙酮酸的代谢异常。研究表明BCAA在BCAA转氨酶的作用下进行可逆反应，生成各自的支链α酮酸及谷氨酸，后者能够促进丙酮酸转氨至丙氨酸。在正常心脏中，支链氨基酸直接抑制丙酮酸脱氢酶复合物(PDH)活性，从而减少葡萄糖氧化并促进脂肪酸氧化。在支链氨基酸分解代谢缺陷的心脏中，葡萄糖摄取，氧化，糖原含量和蛋白质糖基化显著降低[19]。同时BCAA代谢产物还会经过一系列酶促反应形成终末产物乙酰辅酶A和琥珀酰辅酶A，进一步参与三羧酸循环产生能量和糖异生过程[20]。本研究中WM-ADM小鼠血清中乳酸、丙酮酸含量与WM小鼠相比具有显著差异说明糖代谢发生紊乱，而在TSP1-/--ADM组小鼠血清中乳酸、丙酮酸含量变化程度低于WM组小鼠。由此，我们认为ADM会显著影响小鼠体内的糖代谢，加重心肌组织的损伤。而TSP1-/-组小鼠可能通过维持其心脏中糖代谢的平衡，最终减弱ADM造成的心肌损伤。本研究不足之处在于仅采用了1H NMR进行代谢组学研究，未对标志性差异物采用UPLC-MS进行靶标分析，从而对相关代谢物进行准确鉴定。

本研究发现敲除TSP1可有效地减弱ADM造成的心肌损伤，通过基于1HNMR的代谢组学研究，发现其机制可能与通过维持与氨基酸和糖相关的代谢平衡相关。

利益相关声明：论文所有作者共同认可论文无关利益冲突。

作者贡献说明：研究设计为占敏与杨豆，研究方案执行与实施为占敏、卓丰与吴敏，数据整理为李科浩与张守华，统计分析及论文撰写为李科浩，论文审阅为杨豆。