鸡源奇异变形杆菌的分离鉴定及生物学特性分析

闫建英，李虎，邢潇月，刘祥杰，梁成孔，张家浩*

（1.和田地区农业农村局 新疆和田 848000；2.塔里木大学动物科学与技术学院 新疆阿拉尔 843300；3.塔里木畜牧科技兵团重点实验室 新疆阿拉尔 843300；4.新疆生产建设兵团塔里木动物疫病诊断与防控工程实验室 新疆阿拉尔 843300）

奇异变形杆菌（Proteus mirabilis）是肠杆菌科变形杆菌属，是一种革兰氏阴性条件致病菌[1]。该菌在自然界分布极广，不仅可以在人和动物体内生存[2]，也可存在于土壤和污水等环境中。该菌可感染宿主种类多样，能感染猪、牛和羊等常见养殖动物，也有文献报道在水貂、狐狸和蛇等动物中分离到该菌[3]。近年来鸡感染奇异变形杆菌的报道较多[4-7]，给鸡养殖业带来巨大的经济损失。

随着抗生素的滥用，奇异变形杆菌的耐药性逐渐增强，对禽类疾病的治疗与预防造成了极大的困难。贾沅铮[4]等分离的52 株奇异变形杆菌对红霉素等5 种抗生素100%耐药；对环丙沙星等9 种抗生素耐药性均高于50%。徐睿[5]等分离的2 株奇异变形杆菌耐药率分别为78.6%（11/14）和71.44%（10/14）。

本试验无菌采集新疆阿克苏地区某鸡场病鸡病料，进行病原检测和细菌的分离培养，通过形态学观察、生化试验和16S rRNA序列分析进行鉴定，同时研究其耐药性和致病性，为防控奇异变形杆菌在鸡群中的传播提供参考。

1 试验材料与方法

1.1 样品来源

2022 年7 月，新疆阿克苏地区某鸡场雏鸡出现腹泻、消瘦、挤作一团；剖检病变主要为肝脏、脾脏等器官出现不同程度的肿大。为确定致鸡群发病的病原，采集病死鸡病料置于无菌自封袋中带回实验室诊断。

1.2 试验动物

15 只3 日龄雏鸡，购自塔里木大学动物试验中心。

1.3 试验方法

1）分离和纯化。用高压灭菌棉拭子蘸取肝脏内部细菌接种于BHI 固体培养基上，37℃培养12h，挑取单菌落划线接种于SS 琼脂固体培养基上，37℃培养12h 后，取单个菌落进行革兰氏染色镜检，观察细菌形态及染色特性。

2）生化鉴定。将分离株的纯培养物分别接种于细菌微量生化反应管中37℃培养24h，观察试验结果。

3）16S rRNA 基因的扩增。参照文献[4]合成细菌16S rRNA 基因通用引物，预期扩增产物长度约为1,465bp。用细菌基因组提取试剂盒提取分离菌株的DNA 进行PCR 扩增。PCR 反应体系：模板1μL，EasyTaq SuperMix 12.5μL，上、下游引物各0.5μL，灭菌双蒸水补齐至25μL。PCR 扩增程序为：94℃300s；94℃30s，56℃30s，72℃90s，72℃600s，35 个循环。将经过1%琼脂糖凝胶电泳检测合格的PCR 产物送至上海生工测序，对所测序列在NCBI 数据库中进行比对，使用DNA star 对所测的菌株做进行系统发育进化树构建及相似性分析。

4）药物敏感性试验。按照纸片琼脂扩散法，对分离菌株进行药物敏感性试验。将17 种所测药敏片平铺在平板表面，37℃培养24h，测量抑菌圈直径，判断分离菌的耐药性。

5）动物回归试验。挑取培养单个菌落在BHI 液体培养基中培养，直至浓度达到3×108cfu/mL。动物分组：将15 只3 日龄雏鸡随机分为3 组，每组5 只。第1、2 组为试验组，第3 组为对照组。第1 组腹腔注射0.5mL 含3×108cfu/mL 的菌液，第2 组腹腔注射0.5mL 含3×107cfu/mL 的菌液，第3 组为空白对照组，不作任何处理。每日观察、记录试验雏鸡情况。

2 结果与分析

2.1 分离纯化结果

37℃培养24～48h 后，在SS 琼脂固体培养基上生长出中心黑色，周围白色或橘色的圆形菌落；在BHI 固体培养基上生长出表面光滑，边缘整齐的无色透明菌落。

2.2 革兰染色结果

菌体呈杆状或短杆状、革兰染色阴性、大小均匀、两端钝圆、多为散在排列（见图1）

图1 分离菌株革兰染色镜检结果图（10×100）

2.3 生化鉴定结果

试验结果显示，分离菌不发酵麦芽糖、蔗糖、乳糖，甘露醇、赖氨酸脱羧酶、精氨酸脱羧酶、氧化酶试验显示阴性；分离菌发酵木糖、葡萄糖、覃糖，山梨醇、尿素分解、枸橼酸盐试验为阳性。参考《伯杰氏细菌鉴定手册》(第8 版)[8]确定分离菌符合奇异变形杆菌的生化特性。

2.4 16S rRNA 扩增结果

将PCR 扩增产物使用1%琼脂糖凝胶电泳检测，结果显示扩增条带约为1,400bp 左右，与预计大小相同。将分离菌株分别命名为X001。

2.5 16S rRNA 序列比对结果与系统发育树的构建

由图1 可知，分离菌株S001 与登录号为KC456549、OL629184、OL629187、OL629213、OL629209、OL629230、ON460264、ON329112 等的奇异变形杆菌处于同一分支，将登录号为ON000821 的枯草芽孢杆菌作为外围支（见图2）。

由图2 同源性分析表可知，菌株X001 与8 株奇异变形杆菌参考株同源性均高于99.9%，与登录号为ON000821 的枯草芽孢杆菌同源性为78.2%。结合分离菌的形态、生理生化特征和序列比对结果，将菌株X001 鉴定为奇异变形杆菌。同源性分析（见图3）。

图2 系统进化树

图3 同源性分析

2.6 药物敏感性试验结果

药敏结果显示：分离菌对复方磺胺甲噁唑表现为中介、对庆大霉素和丁胺卡那表现为敏感，对其他5 种抗生素表现为耐药。试验结果见表1。

表1 分离菌株的药物敏感性试验结果

2.7 动物回归试验

攻毒后12h，第1 组雏鸡死亡2 只，试验组其他雏鸡出现临床症状，表现为精神萎靡、食欲减退、缩颈闭目、畏冷、挤作一团、排白色粪便；接种24h 后，第1 组雏鸡全部死亡。对死亡雏鸡剖检可见肝脏轻微肿大、表面淤血，脾脏、肾脏有不同程度的肿大。第2 组雏鸡至试验结束未发生死亡。第3 组雏鸡至试验结束较接种前无变化，各组织器官均未分离出细菌。将试验组死亡雏鸡肝脏等组织进行细菌分离培养，菌落形态、革兰染色和生化试验结果与原分离菌一致，16S rRNA 检测结果也显示分离出的细菌为奇异变形杆菌。

3 讨论

在科学技术和经济快速发展的时代下，抗生素被广泛用于动物的感染性疾病和保健品，导致奇异变形杆菌的耐药性逐渐增强，甚至出现了多重耐药，使本病的防治十分棘手。本研究中，分离菌X001 表现多重耐药，以往的研究中也有类似结果[4-7]。药敏试验表明，分离菌X001 对复方磺胺甲噁唑表现为中介、对庆大霉素和丁胺卡那表现为敏感，对其他几种抗生素表现为耐药。结合以往研究可知，国内禽源奇异变形杆菌对常用抗生素的耐药情况较为严重，对药物的敏感性越来越低，耐药谱不断扩大。因此临床用药时，一定要先做药物敏感性试验，根据试验结果来选择治疗药物。此外，在养殖过程中要对奇异变形杆菌感染引起足够的重视，在平时的饲养中要注意加强饲养管理，提高养殖动物的免疫力，坚持防大于治的原则，在治疗中要合理用药。

雏鸡回归试验表明该分离菌可引起雏鸡精神萎靡、食欲减退并造成死亡，有较强的致病性，由于该菌是人畜共患病原菌，因此相关的蛋肉产品可能会对食品安全构成威胁。试验雏鸡症状和剖检病变与鸡场发病鸡相同，表明奇异变形杆菌是该鸡场雏鸡发病、死亡的致病菌。在本病例中，笔者根据药敏试验结果使用庆大霉素进行治疗，用药后鸡场病鸡临床症状消失，死亡率下降。

我国社会经济的快速发展虽然推动着家禽养殖行业的向前迈进，但因为巨大的市场竞争力和饲养周期的缩短使鸡群的免疫力逐渐地降低，尤其是雏鸡的奇异变形杆感染率增加，这对于食用性动物源产品是一种潜在的巨大的危害。因此，需要对该地区鸡场提供可行性的建议，首先要合理规范的使用抗菌药，以降低耐药性、减少多重耐药菌株的出现。与此同时，需要提高动物的饲养技术和管理模式，对圈舍以及养殖环境制定一个合理规范的清洁消毒计划，坚持自繁自养，全进全出，防患于未然。

4 结论

本试验从新疆阿克苏地区某鸡场病鸡体内分离到1 株细菌，经细菌分离培养、形态学观察、生化鉴定和16S rRNA 序列鉴定，确定分离菌为奇异变形杆菌。确诊引起该鸡场雏鸡发病、死亡数量增加的病因为奇异变形杆菌感染，表明新疆阿克苏地区鸡群中存在奇异变形杆菌感染，应进一步改善鸡场饲养管理模式并加强禽类食品的安全卫生检测工作。药敏试验表明分离菌具有多重耐药性，应加强对奇异变形杆菌耐药性的检测。本研究为该病的防治和临床合理用药提供了科学依据。■