γ-聚谷氨酸发酵液对小白菜生长及氮磷肥料利用率的影响

何 宇，吕卫光，李双喜，郑宪清，张翰林，张娟琴，张海韵，白娜玲，*，刘善良

(1.上海海洋大学 海洋生态与环境学院，上海 201306； 2.上海市农业科学院 生态环境保护研究所，上海 201403； 3.农业农村部上海农业环境与耕地保育科学观测试验站，上海 201403； 4.上海市农业环境保护监测站，上海 201403； 5.上海市设施园艺技术重点实验室，上海 201403； 6.时科生物科技(上海)有限公司，上海 201108)

我国是世界上第一大蔬菜生产和消费国，保证农作物的产量和品质，是农业可持续发展的根本任务。早在十年前，我国人均年蔬菜占有量就达到440 kg，而世界人均年蔬菜占有量仅为240 kg。肥料中包含植物生长所必需的氮磷钾等营养元素，因此，为满足蔬菜种植需求，获得较高的产量，肥料的投入量日渐增长。我国氮肥的用量已在30年间增加了近4倍，占全球氮肥用量的30%左右[1]。但边际收益递减理论表明，持续增加化肥用量，并不能促进肥效的发挥[2]和有效保证粮食增产。过剩的养分不仅降低了蔬菜的产量和品质，降低肥料利用率，还会加剧土壤酸化，并通过挥发、淋溶等途径进入大气和水体，造成养分的流失，引发严重的环境问题[3]。虽然在我国开展化肥使用量零增长行动后，化肥施用量已出现逐年降低的趋势，肥料利用率也提升了5%[4]，但相较欧美发达国家，我国肥料偏生产力和当季利用率仍处于较低水平。

在国家大力推进绿色投入品的研发和应用背景下，具有环境友好、绿色高效的微生物肥料被广泛运用于农业生产中。可利用微生物自身或其发酵产次级代谢物的功能性，直接或间接地提高土壤有效养分可利用性，达到促生效果[5]。γ-聚谷氨酸(γ-polyglutamic acid，γ-PGA)作为一种环境友好型高分子聚合物，早在20世纪30年代就被发现于炭疽芽孢杆菌(Bacillusanthracis)的荚膜中[6]，经研究发现，其具有多种优良性能，在医药、环境、农业等领域中具有广阔的应用前景。因γ-PGA良好的生物降解性，在医药方面被用作制备药物载体，解决了天然药物难溶、不稳定所造成的药物利用率低这一难题[7]；γ-PGA还具有良好的吸水性和黏结性，可利用生产菌株发酵制备γ-PGA，将其作为污水处理中的絮凝剂使用，絮凝活性较佳[8]。γ-PGA本身含有大量游离的亲水性负电α-羧基和氢键，因此有极强的吸附特性，负电羧基与土壤养分离子进行吸附交换的能力远高于土壤本身[9]，且能有效阻止肥料养分与土壤微量元素结合，大大减少养分淋失，提高肥料利用率，因此常用作农业生产中的肥料增效剂和缓释剂。王进[10]将枯草芽孢杆菌发酵产物直接作为菌肥施用，试验结果表明，添加菌肥与不添加菌肥相比，植株生长明显，产量高30.4%，株高和茎粗也明显优于后者，既促进了植物生长又达到了肥料减量的效果。笔者前期研究发现，低γ-PGA施用量对作物增产及肥料利用率提高亦有显著影响[11]。γ-PGA提升作物养分利用，改善土壤环境的作用早已得到验证，但现有研究多针对γ-PGA纯品对农作物和土壤的影响，但纯品的制备过程大多需要提取、纯化等繁琐的流程，在这一过程中也不可避免地会有部分产物的损失。目前，对于直接施用含有活性菌体的γ-PGA发酵液的研究较少，如果可以验证其肥效，不仅可在工艺上简化流程，降低制备成本，保证有效成分的同时也可推动绿色投入品的研究和应用。基于此，本研究从减氮增产角度出发，利用筛选到的γ-PGA高产菌枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilissp. A-5)制备γ-PGA纯品和发酵液，设计小白菜盆栽试验，研究其对小白菜品质和产量、土壤环境和养分的影响，通过计算肥料利用率和经济效益，验证γ-PGA发酵液直接作为菌肥的可行性，为提高农产品品质和绿色可持续生产提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试土壤取自上海市农业科学院庄行试验站(30°53′N，121°23′E)，土壤基本理化性质分别为：pH值7.78，有机质含量13.80 g·kg-1，全氮含量0.9 g·kg-1，全磷含量1.6 g·kg-1，速效氮含量72.02 mg·kg-1、速效磷含量20.74 mg·kg-1。供试小白菜品种为上海青，生育期60 d。供试无机肥料为尿素(纯N ≥ 46%)、过磷酸钙(P2O5≥ 12%)和氯化钾(K2O ≥ 60%)。试验所用γ-PGA和发酵液均由本实验室分离保存的Bacillussubtilissp. A-5制得。

LB培养基：酵母抽提物5 g，胰蛋白胨10 g，氯化钠10 g，1 L蒸馏水，调pH值至7.0，121 ℃灭菌20 min；发酵培养基：葡萄糖40 g，谷氨酸钠40 g，酵母抽提物5 g，MgSO40.25 g，K2HPO42 g，1 L蒸馏水，调pH至7.2，115 ℃灭菌10 min。

发酵液的制备：将Bacillussubtilissp. A-5单菌落接种于LB液体培养基中，37 ℃培养12～24 h，制得菌体母液。将Bacillussubtilissp. A-5母液以5%的接种量接入发酵培养基中，37 ℃下200 r·min-1培养2 d，制得发酵液。

γ-PGA纯品的制备：将发酵液用浓盐酸溶液调节pH值至2.0～4.0，4 ℃下12 000 r·min-1离心20 min，去除菌体，上清液中加入3倍体积的预冷无水乙醇，摇晃至产生沉淀，4 ℃静置过夜；8 500 r·min-1离心15 min，去除上清液，将沉淀用去离子水复溶，透析12 h，透析结束后使用真空冷冻干燥法进行干燥处理，制得γ-PGA纯品。其中γ-PGA产量为34.21 g·L-1，转化率超过75%，分子量约为4 600 ku。

1.2 试验设计

采用盆栽试验，盆钵规格67.5 cm×17.0 cm×15.0 cm，每盆装土10 kg。试验共设置5个处理：(1)不施肥—CK；(2)常规施肥—CF；(3)减30%氮肥—-N；(4)减30%氮肥+γ-PGA纯品—-N+PGA；(5)减30%氮肥+产γ-PGA发酵液—-N+FJY。其中，γ-PGA施用量为60 mg·kg-1，发酵液为A-5菌株在发酵培养基中37 ℃培养2 d而得，根据γ-PGA浓度和所需纯品量折算施用量。试验采用随机区组排列，每个处理设置4个重复。待植株长出3个叶片后进行间苗，每盆保苗7棵。各处理具体施肥量见表1。γ-PGA纯品氮磷钾含量：N 0.15%， P2O50.11%， K2O 0.41%；发酵液氮磷钾含量：N 0.3%， P2O50.16%， K2O 0.11%，γ-PGA纯品和发酵液中氮磷钾不会对整个实验存在干扰。

表1 各处理肥料添加量

1.3 测定内容及方法

小白菜收获时，使用SPAD-502P叶绿素仪测定植株叶片叶绿素相对含量(SPAD)，并收取盆中所有小白菜测定质量，并按盆钵面积折算为每公顷产量。采用2，4-二硝基苯肼法测定植株维生素C(VC)含量，水杨酸法测定植株硝态氮(NO3-N)含量[12]。植株在105 ℃杀青30 min，65 ℃烘干至恒重，称取干物质质量并研磨过筛；硫酸-过氧化氢法消煮后，植株全氮(P-TN)用凯氏定氮法测定，全磷(P-TP)用钒钼黄比色法测定[13]。

用直径4 cm的不锈钢采土器采集0～20 cm土壤样品，将其装入自封袋中，做好标记，带回实验室风干后过筛，用于测定土壤理化指标。土壤理化性质测定方法[14]：凯氏定氮法-自动定氮仪测定全氮(S-TN)含量，高氯酸-硫酸-钼蓝比色法测定全磷(S-TP)含量，重铬酸钾-硫酸消化法测定有机质(SOM)含量，氯化钠浸提-蒸馏法测定速效氮(S-AN)含量，0.5 mol·L-1NaHCO3浸提-钼蓝比色法测定速效磷(S-AP)含量[15]；蔗糖酶(S-SC)活性采用3，5-二硝基水杨酸法测定，以每天每克土样中产生1 mg还原糖为单位，脲酶(S-UE)活性采用靛酚蓝比色法测定，以每天每克土样中产生1 μg NH3-N为单位，过氧化氢酶(S-CAT)活性采用过氧化氢-硫酸铜比色法测定，以每天每克风干土样催化1 μmol H2O2降解定义为一个酶活力单位。

1.4 相关指标计算与数据处理

氮肥偏生产力(partial factor productivity of applied N， PFPN)=施氮区产量×肥料用量-1；

氮肥农学效率(agronomic efficiency of applied N， AEN)=(施氮区产量-空白区产量)×施氮量-1；

氮肥当季利用率(nitrogen use efficiency， NUE)=(施肥区养分含量×植株干重-空白区养分含量×植株干重)×100%×施肥量-1；

磷素相关计算方法同氮素。

使用Microsoft Excel对原始数据进行初步整理，SPSS 16.0软件进行单因素方差分析，Origin 2021软件绘制结果图。

2 结果与分析

2.1 不同处理对小白菜产量和品质的影响

各处理不同程度地影响了小白菜产量和品质(表2)。与不施肥CK相比，施肥处理均显著提高了小白菜产量，其中，-N+FJY处理的产量和叶面积均显著大于其他处理(P<0.05)，产量分别是CK、CF、-N和-N+PGA处理的163.81%、115.10%、137.63%、114.50%，叶面积分别是CK、CF、-N和-N+PGA处理的2.31、1.77、1.80、1.46倍，具有良好的促生效果。-N+PGA处理的产量相较-N处理增加20.19%(P<0.05)，相较未减氮肥的CF处理无显著性差异(P>0.05)。人体从蔬菜中摄入的硝酸盐量占随食物摄入量的80%，因此，硝酸盐(NO3-N)含量是评价蔬菜品质的重要指征；常规施肥CF处理下NO3-N含量显著高于其他处理(P<0.05)，出现硝酸盐富集现象；其次为-N+PGA和-N+FJY处理，-N处理(-N、-N+PGA和-N+FJY)则显著降低了NO3-N含量，结果与CK相近。测定植物的氮、磷含量可了解植物生长状况和养分需求；各施肥处理P-TN含量均有所增加，分别较CK提高11.78、10.37、12.49和12.85 g·kg-1，但CF、-N、-N+PGA和-N+FJY处理之间差异不显著；P-TP(P2O5)含量与P-TN结果大体一致，含量大小为-N+FJY>-N+PGA>-N>CF>CK，-N+FJY处理可更好地促进植株对磷的积累。与CK相比，CF、-N、-N+PGA和-N+FJY处理均提高了小白菜叶绿素相对含量，但CF、-N、-N+PGA和-N+FJY处理之间无显著差异。各处理对维生素C含量无显著影响。

2.2 不同处理对土壤理化性质及酶活性的影响

土壤氮、磷含量是指征土壤肥力，评价施肥合理性的根据。如图1所示，CF、-N、-N+PGA和-N+FJY处理对土壤全氮(S-TN)、土壤全磷(S-TP)和土壤速效磷(S-AP)含量均有不同程度的影响。相对于CK和-N处理，CF、-N+PGA和-N+FJY处理下S-TN含量显著提高(P<0.05)，-N+PGA和-N+FJY处理下S-TN含量差异较小，数值上仅相差0.01 g·kg-1。-N处理的S-TN含量虽然也较CK有所增加，但与CK间并无显著差异。减施氮肥(-N、-N+PGA和-N+FJY处理)对S-TP含量影响不明显，S-TP含量最高的是-N+PGA处理(1.75 g·kg-1)，相较含量最低的CK增加了48.31%。-N+PGA处理下的S-AP含量显著高于其他处理(P<0.05)，但-N+FJY处理的S-AP含量低于其他施肥处理，与不施肥的CK含量相近。各处理间S-AN未见显著变化。

表2 不同处理对小白菜产量和品质的影响

图1 不同处理对土壤氮磷含量的影响Fig.1 Effect of different treatments on N/P content of soil

由表3可知，-N+PGA和-N+FJY处理下土壤pH值最低，显著低于CF处理(P<0.05)，CK、-N与CF处理相比pH值未见明显变化。土壤有机质(SOM)与土壤肥力密切相关，通常呈正相关性；-N和-N+PGA处理显著提高了收获季SOM含量，而CF处理低于CK处理，证明了大量单施化肥会导致有机质降低这一结论[16]；微生物可以分降土壤有机质，释放大量营养成分，-N+FJY处理在SOM出现的差异，可能由于菌体的存在促进植物生长而引起土壤贫瘠所导致(表2)。酶活性方面，土壤过氧化氢酶活性未见显著差异，大体保持在45.29～47.65 μmol·d-1·g-1；减氮可提高土壤中蔗糖酶(S-SC)活性，在-N+PGA处理中，S-SC较CK高出66.48%；-N+FJY处理下，脲酶活性较其他处理显著提高137.24%(CK)、38.13%(CF)、28.91%(-N)、15.46%(-N+PGA)。

表3 不同处理对土壤理化性质和酶活性的影响

2.3 肥料利用率和生产效益

根据1.4节中方法计算肥料偏生产力、农学效率和当季利用率的结果如表4所示。肥料偏生产力表示投入单位肥料所收获的作物产量，是肥料施用量和产量的直接比值，受肥料施用量的影响[17]。本实验中，-N处理的PFPN显著高于CF处理，符合随着氮肥用量的降低，PFPN呈逐渐增加的趋势，而在-N处理的前提下，-N+PGA和-N+FJY处理提高了土壤养分含量，又进一步提高了PFPN，结果为-N+FJY>-N+PGA>-N；减少总施氮量是常见的减肥措施，本试验中各处理下磷肥施用量一致，但PFPP呈现-N+FJY>-N+PGA>CF>-N的趋势，其中-N+FJY较-N处理高出37.63%(P<0.05)。农学效率指示单位肥料施加量所产生的产量增加值[18]，呈现的趋势与偏生产力较一致。肥料当季利用率方面，-N+FJY处理的NUE和PUE显著高于其他处理(P<0.05)，分别为52.15%和8.03%；-N+PGA处理下NUE(42.55%)显著高于CF(28.00%)和-N处理(28.48%)，而PUE则无明显差别。

表4 不同处理下肥料偏生产力、农学效率和当季利用率

小白菜按照市场均价6元·kg-1，为方便计算，将盆栽肥料使用量换算为每公顷田间施肥量。γ-PGA纯品价格参照西安全奥生物科技有限公司99% γ-PGA的售价300元·kg-1。γ-PGA发酵液因没有涉及纯化等步骤，因此按照γ-PGA纯品成本价的80%计算。不同处理下小白菜种植的经济效益见表5。简要计算后结果表明，CF处理氮肥用量比-N处理多30%，而净产值只高出-N处理19.47%；-N+FJY处理的净产值为所有处理中最高，较CK增收约4.81万元·hm-2，较CF处理增收0.85万元·hm-2；与-N处理净产值相比，-N+PGA增加6.58%，-N+FJY增加26.93%，说明含有活性Bacillussubtilissp.A-5的发酵液处理有更高的经济效益。

表5 不同处理下的小白菜种植经济效益

3 讨论

小白菜生长周期短，富含维生素、纤维素和矿物质，具有降血脂等功效，是最常见的蔬菜之一。但在种植过程中，往往肥料投入量是蔬菜生产理论需肥量的数倍，造成产量、品质下降和资源的浪费。研究表明，将γ-PGA作为微生物肥料施用，可明显提高作物的叶面积和产量，减少化学肥料使用量[19-20]。目前，利用微生物发酵法可获得浓度、品质较高的γ-PGA，文献报道的γ-PGA发酵菌株多为芽孢杆菌类，是重要的微生物资源。本实验使用的枯草芽孢杆菌A-5具有较高的γ-PGA生产能力，施用通过它发酵制得的γ-PGA纯品和γ-PGA发酵液，小白菜产量和养分均大幅度提升，但发酵液的效果要高于γ-PGA纯品，因此，我们初步推测，施加γ-PGA发酵液的促生效果要优于γ-PGA，而γ-PGA纯品需要发酵液经过纯化、干燥等处理才能制得，因此使用发酵液也可以在一定程度上降低成本。出现这样的结果，可能是因为发酵液中不仅含有可促生的γ-PGA成分，同时存在大量活性菌株B.subtilissp. A-5，其可在土壤中稳定存在，并进一步活化土壤养分，增强植株光合作用，从而增加作物产量[21-22]。具体机制需要后续通过qPCR、高通量测序等手段进行分析。

蔬菜是极易富集硝酸盐的作物，我国食品安全国家标准中污染物限量未规定硝酸盐的限量值，因此根据WHO/FAO规定的ADI值为参照提出的蔬菜硝酸盐污染程度及食用安全性评价成为该指标的评价标准。发酵液处理后的小白菜硝态氮含量远低于我国规定最低限值(<432 mg·kg-1)，符合安全标准；而常规施肥(CF)处理中小白菜硝态氮含量为439.03 mg·kg-1，超过了最低限值，需要引起重视。本实验还发现，施氮量和硝态氮含量存在一定正相关性，说明供氮水平可影响蔬菜的硝酸盐累积量，这与前人的研究结论一致[23]。另外，微生物菌剂中存在的大量活性菌株也有一定降低硝酸盐含量的作用[24]。因此，在生产中控制施氮量，可有效降低硝酸盐的积累，配合微生物菌剂的使用，以保证蔬菜品质和产量。

土壤有机质是指征农业生产力和维持土壤肥力的重要指标。施氮水平会显著影响土壤有机质含量，改变微生物群落组成，而微生物可以分解土壤中的有机质，释放各种营养成分[25]，保障作物的正常生长代谢。王文静等[26]和刘学彤等[27]都指出，相较低量施氮，高量施氮并不利于土壤有机质的积累和养分的释放，本实验结果与上述结论相一致，强调了合理施氮的重要性。土壤酶活性是衡量土壤肥力的重要指标之一，土壤蔗糖酶和脲酶的活性会随微生物菌剂的添加而提升[25]。实验结果表明，在γ-PGA生产菌株存在条件下，γ-PGA对土壤脲酶活性的影响作用更突出。而脲酶对尿素转化过程起到关键性作用，反映土壤供氮能力[28]；结合发酵液处理后小白菜和土壤中的全氮含量结果，推断微生物利用自身生命活动提高土壤根系生物量和酶活性，而γ-PGA的存在为土壤养分和植株建立桥梁，增强了植物对养分的吸收能力，从而提高了植物生物量和肥料利用率。这也进一步说明，土壤酶活性对蔬菜生长中土壤养分的供给有较大的影响作用。过氧化氢酶作为指征土壤分解过氧化氢能力的酶，施用γ-PGA或菌剂后过氧化氢酶活性也会随之提高[29-30]。本实验结果的不同可能是由于，在植株生长发育前期，来自真菌或者植物根系的有毒过氧化氢在过氧化氢酶分解下含量降低，从而使过氧化氢酶的活性也随着作物的成熟而逐渐降低[31]，微生物在土壤中的生命活动会积累过氧化物，促进酶反应的进行，-N+FJY处理过氧化氢酶的提升可能与存在活性菌株A-5有关，因此需要增加取样次数，在不同生长周期采样以明确酶活性在小白菜生育期的变化规律。

γ-PGA可以减少化肥的施用量，因此被认为是一种可持续农业的有效实践。刘乐等[32]研究复合肥和γ-PGA配施对盆栽菠菜的产量和经济效益的影响，结果表明，0.1%的γ-PGA可显著促进菠菜的产量和对养分的吸收，产量较CK提高146.78%，氮磷钾养分平衡状况最佳，经济效益最高，达20万元·hm-2，约为CK经济效益的200%。吴珏等[33]也通过减施化肥研究配施微生物菌剂后青菜的生长状况，发现在减量20.6%条件下，配施微生物肥料可提高青菜株高、株质量和产量等，不同的微生物菌剂处理较常规施肥可达到20%以上的增收率，论证了微生物肥料降低化学肥料使用量的可行性。本文通过简要计算各处理的肥料利用率和收益，证明了不经过提纯的γ-PGA发酵液相较γ-PGA粗产物可达到更好的减肥增产效果，也可获得更高的收益回报。γ-PGA具有广阔的应用前景，如何保持在低生产成本下获得更高的生产效率以及促进肥料利用率的进一步提升，将其广泛地应用于生产种植实践中，有待进一步深入研究。

4 结论

(1)本实验中，与-N处理相比，通过使用枯草芽孢杆菌A-5发酵制得的γ-PGA纯品和γ-PGA发酵液均可不同程度促进青菜生长，产量分别提高20.19%和37.63%；叶面积、植株养分含量也有提高，硝态氮含量显著降低，但-N+FJY处理效果更明显，说明-N+FJY处理相较于-N+PGA处理具备更好的促生能力。

(2)-N+PGA和-N+FJY处理下小白菜土壤总氮含量相较-N显著提高(P<0.05)，但两处理间未见显著差异；-N+FJY处理的速效磷含量显著下降，而-N+PGA和-N处理的含量较高；-N+FJY脲酶活性相较其他处理均显著提高(P<0.05)；蔗糖酶活性为-N+PGA处理最高，其次为-N+FJY处理，两处理间未见显著差异(P>0.05)，上述结果的产生原因推测是菌体生长代谢和γ-PGA的共同作用。减氮条件下，不同处理(-N、-N+PGA、-N+FJY)的土壤总磷含量、过氧化氢酶活性未见显著差异。

(3)在含有大量活性有益菌B.subtilissp. A-5的γ-PGA发酵液处理下，N/P当季肥料利用率显著高于其他处理，较-N处理高出23.67和4.13百分点，既实现了肥料的减施，又促进了植株对肥料的利用效率。另外，减氮30%并添加产γ-PGA发酵液处理的净产值高于-N、-N+PGA处理，可获得更高的经济收益，可见γ-PGA发酵液作为菌肥直接用于农业生产具有可行性。