酶制剂调控反刍动物碳氮减量的研究进展

■刘卓凡 许贵善 李博为 高彦华 刁其玉 董利锋*

(1.中国农业科学院饲料研究所，反刍动物及其幼畜营养代谢中美联合研究中心，北京 100081；2.塔里木大学动物科学与技术学院，新疆阿拉尔 843300；3.西南民族大学生命科学与技术学院，四川成都 610041）

随着人类社会不断的发展与进步，生活质量也在不断提高。但产生的温室效应对环境造成严重影响，在50 年来地球表面的平均温度上升了0.74 ℃[1]。为了缓解气候变暖对世界环境的影响。世界各国政府积极实行了低碳减排的策略。中国为了减少碳排放，发布了《“十四五”生态环境监测规划》，以推动减污降碳协同增效，持续改善生态环境质量，加快实现生态环境监测现代化[2]。在低碳减排政策下，畜牧业的发展方向衍生成为低碳畜牧业，畜牧生产过程中从高碳排转变为低碳排，从线性经济发展转变成循环经济发展。这不仅能够降低畜牧业生产的成本，也能实现生态环境与畜牧业发展统筹兼顾。

联合国粮食及农业组织（Food and Agriculture Organization of the United Nations，FAO）2013 报告指出，全球畜牧业的温室气体排放占14.5%，有39%是动物排放的气体。甲烷（CH4）是一种半衰期较长的温室气体，其增温潜力是二氧化碳（CO2）的28 倍[3]。其中反刍动物的CH4年平均排放量占大气中CH4总量的15%。从营养上来说，由反刍动物瘤胃发酵产生的CH4使饲料能量损失的2%～15%。王效琴[4]运用生命周期方法测算了西安郊区某奶牛场的温室气体排放量，饲料生产加工和粪便贮存占18.97%和16.39%，而奶牛瘤胃发酵的排放量占48.86%，是奶牛养殖过程中最重要的排放源。与此同时，随着我国反刍动物养殖数量的不断扩大，玉米、大豆等饲料原料的进口量也在显著增加；蛋白质饲料资源的稀缺和饲粮蛋白质利用效率较低已成为限制我国反刍动物养殖可持续和高质量发展的重要因素之一。最近的研究表明，饲用的酶制剂能够提高动物的生产性能、营养物质（如蛋白质等）的消化率，降低瘤胃发酵过程和粪便管理过程中的甲烷和氧化亚氮排放量，减轻对环境的污染。因此，本文拟通过总结近年来酶制剂调控反刍动物碳氮减量及其对瘤胃微生物的影响，旨在为后续研究和应用提供思路和借鉴。

1 酶制剂的定义与种类

饲料酶制剂能够促进瘤胃内碳水化合物（纤维和淀粉）和蛋白质的降解，从而提高饲料的消化率和利用率[5]。近年来，有研究表明饲粮种添加外源性酶制剂可作为环境友好型饲料添加剂，用来降低反刍动物甲烷气体的产生。酶制剂种类包括单一酶制剂、复合酶制剂、混合酶制剂[6]。如果根据功能分类，酶制剂又可分成消化性酶（淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶）与非消化性酶（木聚糖酶、果胶酶、纤维素酶、植酸酶等）。世界上已发现酶的品种有3 700多种，生产用酶已达300 多种，作为饲料添加剂用的酶制剂产品亦有20多种[7]。

2 酶制剂对瘤胃甲烷排放量的研究

2.1 酶制剂对奶牛瘤胃甲烷排放量的研究

近年来，有研究认为奶牛饲粮种添加外源性酶制剂在提高产奶量和饲料转化效率的同时，可以降低甲烷的排放强度（CH4/产奶量或CH4/校正乳产量）。Arriola等[8]使用基于VFA的预测模型研究荷斯坦泌乳奶牛不同精料比日粮中添加复合酶制剂对甲烷的影响，发现高精料日粮中添加复合酶制剂可显著降低甲烷的排放量。Oh等[9]采用GreenFeed温室气体测定系统研究外源复合酶制剂（淀粉酶、半纤维素酶、纤维素酶、葡聚糖酶、果胶酶）对荷斯坦泌乳奶牛瘤胃甲烷产量的影响，发现添加10 g/d的复合酶制剂增加了瘤胃中甲烷的排放量（359 g/d），但是与对照组的甲烷排放量（337 g/d）无显著差异（P=0.42）。同样的，奶牛瘤胃甲烷的排放强度（CH4/干物质采食量、CH4/产奶量、CH4/校正乳产量）在两组之间没有显著差异（P＞0.05）。Chung 等[10]将两种不同剂量的外源性纤维素酶制剂（低剂量复合酶制剂：0.5 mL/kg DM；高剂量复合酶制剂：1.0 mL/kg DM）在饲喂前1 h内喷洒于饲料表面，并采用六氟化硫示踪技术研究其对荷斯坦泌乳奶牛瘤胃甲烷产量的影响。结果表明，与对照组相比，添加低剂量和高剂量的酶制剂提高了瘤胃CH4排放量，但是差异不显著（P=0.10）；添加高剂量酶制剂组显著提高了CH4/干物质采食量和CH4/产奶量（P＜0.05），而甲烷转化因子（CH4-E/总能摄入量）在3组之间没有显著差异，其平均值为6.87%。文献中甲烷试验数据具体见表1。

表1 酶制剂对奶牛瘤胃甲烷排放量影响

2.2 酶制剂对肉牛瘤胃甲烷排放量的研究

研究人员使用呼吸测热室的测定方法研究荷斯坦公犊牛日粮中添加蛋白酶，发现单位干物质采食量所产生的甲烷为22.11 g/kg（对照组22.64 g/kg），甲烷能与总能摄入量的比值也降低[11]。酶制剂可以降解破坏秸秆的纤维结构，使瘤胃微生物可以轻易分解秸秆纤维。瘤胃液总挥发性脂肪酸含量增加，乙酸/丙酸降低，大大提高了饲料纤维利用率。张贵花[12]研究不同浓度复合酶处理过的玉米秸秆对西门塔尔肉牛的瘤胃发酵影响，通过GC-2010气相色谱仪对瘤胃液的分析。不同浓度的复合酶处理后的玉米秸秆对瘤胃中甲烷产生量不同，1.5%添加组的甲烷量是最低的（213.64 L/d）。当处理玉米秸秆的纤维分解酶添加量为1.0%时，瘤胃发酵得到显著改善，饲粮养分消化率显著提高，能量及氮利用率提高，氮、磷和甲烷排放降低。班志彬[13]利用开路式呼吸测热室研究纤维素对草原红牛的甲烷排放量的影响，添加纤维素组的甲烷能/摄入总能值为4.03%（对照组为4.43%）。而酶制剂配合活性干酵母却可以显著降低甲烷排放量。日粮中添加200 mg/kg 活性干酵母，与对照组相比，甲烷排放量减少9.55 L/d。具体数据见表2。

表2 酶制剂对肉牛瘤胃甲烷排放量影响

2.3 酶制剂对羊瘤胃甲烷量的研究

Giraldo等[14]研究复合酶对绵羊瘤胃甲烷的影响，将复合酶（286 mg/d）溶解后喷洒至发酵底物，放置室温24 h 后装入尼龙袋并投至发酵系统中，通过Rusitec发酵系统进行检测，添加复合酶的小组甲烷产出量16.0 mmol/d。瘤胃中分解纤维素和木质素等纤维成分，仅仅利用瘤胃微生物分泌的纤维素酶并不能有效的降解这些纤维成分。李燕[15]通过开放式呼吸测热系统研究外源酶对山羊甲烷排放的研究，发现在饲粮中添加0.2%的纤维素酶和木聚糖酶的甲烷排放量为15.51 g/d（对照组：15.61 g/d），甲烷能与总能摄入量的比值比对照组降低了0.93%。在瘤胃中，大部分革兰氏阳性菌会产生氢气、CO2和甲酸等甲烷前体物。可以通过溶菌酶来抑制革兰氏阳性菌。陈亚迎等[16]通过静态模拟瘤胃发酵法研究溶菌酶对瘤胃体外发酵、甲烷生成的影响。实验发现随着溶菌酶含量增加，甲烷生成量逐渐减少，但溶菌酶抑制蛋白降解菌的生长。所以适宜浓度为1 mg/100 mL，短期内不影响饲料消化。具体数据见表3。通过添加酶制剂，来改变瘤胃中的菌群结构或者减少产甲烷菌对底物粗纤维的利用，减少反刍动物瘤胃中甲烷产量，提高饲料利用率并起到了很好的效果。

表3 酶制剂对羊瘤胃甲烷量的影响

3 酶制剂对反刍动物氮代谢的影响

吴爽[17]研究了两种纤维素酶对滩羊的生产性能和氮代谢的影响，Ⅰ组（酶活≥10 000 U/g；秸秆量的0.1%）和Ⅱ组（酶活≥5 000 U/g；秸秆量的0.3%）对秸秆进行发酵处理。处理后秸秆营养成分NDF 与对照组比较分别降低19.75%、17.81%。饲喂滩羊后，结果发现，与对照组相比，添加纤维素酶Ⅰ组和纤维素酶Ⅱ组的氮沉积和氮利用率分别提高了25.45%、20.52%和21.39%、18.00%。田广杰[18]在研究酶菌联用制剂对波尔山羊的产肉性能影响中，设置了4个处理组，分别为对照组（NC)、CY1（0.33%）低剂量组、CY2（0.67%）中剂量组、CY3（1%）高剂量组进行84 d 饲养。结果发现，CY3 组尿素氮在第28 天时比NC 组低，其他高于NC组。第84天时CY1组与CY2组低于其他两组。赵连生[19]研究复合酶制剂对奶牛的营养物质表观消化的影响，饲粮中添加0.10%、0.15%、0.20%复合酶，随着复合酶浓度增加，奶牛的粗蛋白消化率也逐渐提高，分别为81.94%、82.92%、83.65%；在奶牛饲粮中加入0.10%和0.15%复合酶，奶牛血液中尿素氮的含量有下降的趋势，从对照组4.30 mmol/L降到了4.03 mmol/L，并提高了饲料转化率。添加酶制剂后泌乳牛血液中的尿素氮降低，粗蛋白表观消化率提高。林静[20]研究复合酶泌乳奶牛瘤胃发酵及生产性能的影响，试验通过比色法测量了饲喂复合酶10 g/d和20 g/d的泌乳牛的血清样本，发现添加10 g/d复合酶的泌乳奶牛尿素氮含量较低，为14.79 mg/dL。两个复合酶组泌乳牛的粗蛋白表观消化率与对照组比较分别提高了2.67%与2.20%。由此可知酶制剂能够提高家畜对饲料的粗蛋白消化率，减少氮排放，降低氮排放引起的环境污染。

4 酶制剂对反刍动物瘤胃微生物菌群的影响

反刍动物的消化吸收与单胃动物不同，其通过瘤胃中的微生物对植物纤维进行降解消化，会产生对宿主有用的微生物蛋白。调节瘤胃中的微生物菌群对反刍动物至关重要[21]。瘤胃中微生物种类繁多，相互作用，错综复杂。其中就有厌氧菌、原虫、古菌和少数噬菌体。每个菌都有独特的功能，有淀粉降解菌、纤维降解菌、脂肪降解菌、蛋白降解菌以及其他瘤胃细菌[22]。

4.1 酶制剂对瘤胃细菌的影响

瘤胃是一个复杂的微生态系统，里面栖息着厌氧真菌、细菌和原虫，这些复杂的微生物之间通过相互作用、相互协调共同完成对饲料的降解与发酵，除此之外，这些菌群还能够在免疫反应和整体的健康水平方面发挥着重要的调节作用[23]。瘤胃中这3种主要的微生物还存在数量上的差异，其中真菌的数量低于细菌和原生动物（包括原虫在内），数量最多的是细菌，因此细菌在瘤胃中发挥着主要的作用。李朝云[24]在探讨半纤维素酶对瘤胃发酵的影响试验中发现，当添加半纤维素酶后原虫数量降低，甲烷菌数量增加，而总细菌、产琥珀酸丝状杆菌和厌氧真菌无影响。在接下来壳聚糖与纤维素酶及其混合物对瘤胃发酵试验中发现，将纤维素酶80 U/g+壳聚糖80 mg/g混合加入DM底物，会使产琥珀酸丝状杆菌的数量增加，抑制了甲烷菌的生长，减少了甲烷的产量。在不降低干物质消化率的前提下，有益于瘤胃的发酵，提高饲料的利用率。姜碧薇等[25]研究纤维素酶与复合益生菌混合处理荞麦秸秆和苜蓿干草对滩羊的瘤胃微生物多样性的影响，发现试验组厚壁菌门的丰度高于对照组，拟杆菌门的丰度低于对照组，有益于滩羊瘤胃中纤维降解菌的生成。

4.2 酶制剂对瘤胃产甲烷菌的影响

产甲烷菌是一类区别于细菌且严格厌氧的原核生物，是重要的代谢产甲烷菌的一类古菌[26]。最早鉴定出的甲烷菌包括甲酸甲烷杆菌（Methanobacterium formicium）和巴氏甲烷八叠球菌（Methanosarcina barkeri）。随着分子生物学等技术的不断发展和对产甲烷菌菌株认识的逐步加深，已知的产甲烷菌可以分为甲烷杆菌纲（Methanobacteria）、甲烷球菌纲（Methanococci）、甲烷微菌纲（Methanomicrobia）和甲烷火菌纲（Methanopyri）4个纲，以及甲烷杆菌目（Methanobacteriales）、甲烷球菌目（Methanococcales）、甲烷微菌目（Methanomicrobiales）、甲烷八叠球菌目（Methanosarcinales）、甲烷火球菌目（Methanopyrales）、甲烷胞菌目（Methanocellales）和甲烷原体目（Methanoplasmatales）7个目。甲烷杆菌属（Methanobacterium）、甲烷短杆菌属（Methanobrevibacter）、甲烷微菌属（Methanomicrobium）和甲烷八叠球菌属（Methanosarcine）是广泛存在于反刍动物瘤胃内的4 个产甲烷菌属[27]。近年来，人们更多地利用系统发育学分类法，依据物种间小亚基核糖体核苷酸差异性的方法被逐渐应用到产甲烷菌的鉴定和分类中[28]；以16S rRNA/mcrA 功能基因克隆文库等为代表的分子生物学技术也被逐渐应用到分析产甲烷菌的结构组成、群落多样性、菌群功能及其代谢机理的研究中。

瘤胃产甲烷菌生存在严格的厌氧环境中，通过CH4的生物合成作用形成维持细胞生存所需的能量，具有独特的生物化学代谢途径[29]。产甲烷古菌能够将CO2、H2、甲 酸 等 物 质 转 化 成 为CH4或 者CH4和CO2。韩林等[30]在研究木聚糖酶与枯草芽孢杆菌对荷斯坦公牛瘤胃微生物的影响中发现添加木聚糖酶的试验组与对照组相比，甲烷排放量减少。在木聚糖酶与枯草芽孢杆菌相互协助下，可以显著降低瘤胃中原虫数量。陈亚迎[31]研究乳酸链球菌素和溶菌酶对湖羊生长性能、瘤胃发酵及微生物菌群的影响，结果表明，溶菌酶可以增加月形单胞菌和琥珀酸弧菌等丙酸生成菌的相对丰度，促进更多的H+用于丙酸生成。高浓度的溶菌酶会减少甲烷菌、原虫的数量。陈宇[32]通过体外培养研究外源酶对湖羊瘤胃微生物区系的影响，在培养液中添加10 mg/kg 木聚糖酶和纤维素酶，发现外源酶可以促进纤维降解菌的繁殖生长，使产甲烷菌浓度极显著降低。

5 总结

随着中国畜牧业的发展，反刍动物碳氮污染是近年来比较重视的问题。反刍动物养殖业碳排放和氮排放不仅会对环境造成污染，也是对饲料营养的浪费。人们生活水平的提高和对营养的关注，扩大牛羊肉和奶业生产将是大势所趋；但这也势必对甲烷等温室气体的减排工作带来一定的压力。在降低碳氮减排上，酶制剂可以降低秸秆结晶度，破坏细胞壁，提高秸秆降解率和营养成分含量，从而提高反刍动物粗蛋白表观消化率，降低氮排放，提高饲料利用率，减少营养物质的流失；酶制剂也改善瘤胃发酵类型，降低粗纤维，使产甲烷菌对粗纤维的利用减少。但有时添加酶制剂对降低反刍动物甲烷排放不起作用。可能是动物瘤胃内微生物菌群间相互作用的未知性限制了研究，未来可在统筹兼顾菌群间的相互作用下筛选出能提高生产效率又能有效抑制甲烷产生的酶制剂。