响应面法优化白芨多糖提取工艺

窦 欣

（陕西能源职业技术学院医学院，陕西西安 710613）

1 材料与方法

1.1 实验材料与设备

白芨（产地：云南，批号：20200820）；乙醇、氯仿、正丁醇、浓硫酸、D-葡萄糖、苯酚，以上试剂均为分析纯，天津科密欧化学试剂有限公司。

PD5-5型冷冻干燥机，SIM；KQ-500DA数控超声波清洗器，昆山舒美；RE-52A旋转蒸发器，上海亚荣生化仪器厂；p4紫外可见分光光度计，上海美谱达仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 白芨多糖的提取

参考孔令珊[1]将白芨片粉碎，将粉末全部通过20目筛，称取过筛后的粉末约20g按料液比1：4的比例加入95%的乙醇溶液进行回流提取2h，进行2次，弃去提取液，残渣烘干备用。

称取上述白芨粉末2g以料液比1：20加入蒸馏水，45℃下以超声功率100W超声波辅助提取3次，每次1h。将所有滤液进行浓缩并将浓缩液置于分液漏斗中，用Sevag法除去蛋白后将滤液继续浓缩至稠膏状，再加入4倍量的95%乙醇放置过夜，使其沉淀完全，将沉淀物进行冷冻干燥，即得白芨多糖。

1.2.2 白芨多糖的含量测定方法

（1）标准曲线的绘制

参考刘长命等[2]的方法加以改变进行白芨多糖测定时标准曲线的绘制；准确称取D-葡萄糖对照品0.0104g于250mL容量瓶中进行定容。分别量取葡萄糖标准溶液0.0、0.8、1.2、1.6、2、2.4、2.8、3.2、3.6mL于试管中，再分别加入4.0、3.2、2.8、2.4、2.0、1.6、1.2、0.8、0.4mL蒸馏水，再各加2mL的6%苯酚溶液、10mL的浓硫酸摇匀，静置30min。以溶剂空白作为对照溶液，以490nm作为测定波长进行吸光度测量。测量结果以葡萄糖溶液浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线，得到线性方程与相关系数。

（2）方法学考察

利用方法学考察的实验内容对苯酚-硫酸测定白芨多糖含量进行稳定性、精密度、回收率、重复性等方面的考察。

（3）白芨多糖含量计算

冷冻干燥后白芨多糖经过粉碎，精密称取约0.05g，加入蒸馏水充分溶解后，定容至100mL，作为样品溶液待测。应用1.2.1中方法将测得样品的吸光值代入标准曲线回归方程，计算出白芨多糖的含量。

1.2.3 白芨多糖得率的计算

将1.2.1中计算得到的白芨多糖含量按照公式（1）计算白芨多糖得率。

式中：C为样品浓度（g/mL），V为定容后的体积（V），M为样品质量（g）。

1.2.4 单因素考察白芨多糖提取条件

在固定超声提取功率为100W的条件下通过单因素考察不同条件下白芨多糖的得率从而得到白芨多糖提取的最佳条件。

（1）提取温度对白芨多糖提取的影响

将超声提取时的温度设定为20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃，在料液比为1：20、提取时间为30min、提取功率100W的条件下进行白芨多糖的提取。

（2）提取时间对白芨多糖提取的影响

将超声提取时间设定为20min、30min、40min、50min、60min，在料液比为1∶20、提取温度为45℃、提取功率100W的条件下进行白芨多糖的提取。

（3）料液比对白芨多糖提取的影响

将提取时的料液比设置为1∶10，1∶15，1∶20，1∶25，1∶30，提取时间为30min，提取温度为45℃、提取功率100W的条件下进行白芨多糖的提取。

1.2.5 响应面分析优化白芨多糖提取工艺

在单因素实验结果的基础上采用Box-Benhnen中心组合实验设计原理对于超声辅助提取白芨多糖工艺进行优化，并采用三因素三水平响应面分析方法优化白芨多糖提取工艺（表1）[3]。

表1 超声波辅助提取白芨多糖响应面分析实验因素及水平设计表

2 结果与分析

2.1 标准曲线的绘制

采用1.2.2项下方法，以吸光度为纵坐标，葡萄糖溶液浓度为横坐标所得的标准曲线回归方程为：y=3.0567x-0.0058，r=0.9997。结果说明线性关系良好。

2.2 方法学考察

2.2.1 稳定性试验

精密吸取白芨多糖样品溶液0.4mL，按照1.2.2项下的方法每隔一定时间进行一次测定，计算出吸光度的相对标准偏差RSD=1.31%，说明本实验物质在90min内稳定性良好。

2.2.2 重复性试验

取6份前处理过得白芨干燥粉末，各称定5g，按照1.2.1项下方法进行白芨多糖的提取，将每份样品得到的白芨多糖粉末精密称定0.05g，分别溶解后定容于250mL的容量瓶中，得到一定浓度的白芨多糖溶液，每份溶液取0.4mL，按照1.2.2项下的方法进行吸光度的测定，根据结果计算出吸光度的相对标准偏差RSD=2.02%，说明本实验方法重复性良好。

2.2.3 精密度实验

精密量取白芨多糖溶液0.4mL，按照1.2.2项下的方法进行吸光度值的测定，根据结果计算出吸光度的相对标准偏差RSD=0.77%，说明本实验方法精密度良好。

2.2.4 回收率实验

精密量取体积相等的白芨多糖样品溶液10份，其中9份中加入不同量的标准物质，按照1.2.2项下方法进行吸光度的测定，再使用标准曲线计算出白芨多糖的量，根据不加标准物质的样品溶液的吸光度值计算出样品中白芨多糖的量，根据数据可以求得平均回收率为97.81%，相对标准偏差RSD=1.01%。

以上的方法学考察结果说明了本次方法的结果可靠、可以用于白芨多糖含量的检测。

2.3 单因素考察白芨多糖提取实验结果分析

从实验结果可以看到，随着提取温度的升高白芨多糖的得率也在增大，温度达到50℃后，白芨多糖的得率不再增加。所以将50℃定为最佳提取温度。随着提取时间的增加，白芨多糖的得率也在进一步增加，白芨粉末需要溶胀一段时间才能更好地进行有效成分的溶出，所以随着时间的增加白芨多糖的溶出也在增加。但当提取时间达到40min时，白芨多糖的得率出现最大值，随后开始下降，所以将40min作为最佳提取时间。随着料液比的增加白芨多糖的得率也进一步增加，溶剂越多，有效成分的溶出越多，溶解平衡越晚达到，随着料液比的增加白芨多糖的溶出也在增加。但当料液比到达1∶20时，白芨多糖的得率也出现最大值，随后开始下降，所以选择料液比1∶20为最优条件。

2.4 响应面实验结果

通过响应曲面图1的结果进行分析，用白芨得率作为测试变量，得到其最佳值的提取工艺预测如下：超声温度50.99℃、超声时间42.18min、料液比22.07mL/g。但是，考虑到实际条件下的操作，最佳条件可以修改为：超声温度51℃、超声时间42min、料液比22mL/g。使用上述条件进行验证实验，发现白芨多糖的实验收率为69.5%与预测值非常吻合。结果表明，回归模型对白芨得率的预测是准确和充分的。

图1 两因素的交互作用对白芨多糖得率的响应面图

3 结束语

采用超声波辅助水提醇沉法对白芨多糖的提取，用D-葡萄糖在苯酚-硫酸法的基础上建立了回归曲线，并从稳定性、精密度、重复性、回收率等方面进行了验证，证明了本试验方法相对可靠。使用单因素法考察了在固定超声功率100W的前提下应用不同超声时间、超声温度以及料液比的条件下对白芨多糖得率的影响，使用响应面分析法对超声波辅助提取白芨多糖工艺进行优化，得到了最优提取工艺：在超声功率100W的前提下，超声温度51℃、超声时间42min、料液比22mL/g。在此条件下进行了验证实验，得到的白芨多糖的得率为69.5%，符合推测。