HPLC-DAD法测定复方麻黄散中非法添加喹烯酮

陈锡龙，龚旭昊，孙真峥，王庆红，谢丽丽，杨 强，赵 贵*

(1. 贵州省兽药饲料检测所，贵阳 550003：2. 中国兽医药品监察所，北京 100081)

复方麻黄散临床上主要用于治疗肺热咳喘，具有化痰止咳功能[1]。喹烯酮(quincetone)是中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所研制开发的一种新型喹噁啉类抗生素，曾经主要作为饲料药物添加剂被广泛用于养殖生产中。自2020年1月1日起，农业农村部废止仅有促生长用途的药物饲料添加剂等品种质量标准，注销相关兽药产品批准文号和进口兽药注册证书，喹烯酮预混剂在列，标志着喹烯酮及其预混剂被禁用[2]。现在复方麻黄散中发现违规添加喹烯酮，违反了《兽药管理条例》，给动物源性食品安全埋下隐患。同时，喹烯酮药物残留可能存在一定的致癌风险[3]。目前，农业农村部尚未发布兽药中非法添加喹烯酮的检查方法，因此，急需建立相关检查方法，为严查使用喹烯酮提供技术支撑。近年来，陆春波、罗成江分别开展了喹乙醇预混剂及氟喹诺酮类药物粉剂中非法添加喹烯酮的研究[4-5]，中兽药制剂中喹烯酮的检测方法尚未见报道。本试验参考《兽药质量标准》中喹烯酮的测定方法[6]，按照非特定非法添加物质检查方法相关要求[7]，拟建立复方麻黄散中非法添加喹烯酮的HPLC-DAD检查方法，可用于检查复方麻黄散中非法添加喹烯酮。

1 仪器与试药

1.1 仪器与试剂 Thermo Scientific U3000高效液相色谱仪(配DAD检测器)；色谱柱为Hypersil GOLD C18(5 μm, 4.6 × 250 mm)色谱柱。XSR205DU型电子分析天平(感量0.01 mg，德国梅特勒托利多公司)；ME802E型电子分析天平(感量0.01 g，德国梅特勒托利多公司)；超声波清洗器(KQ-300DE，昆山市超声仪器厂)。甲醇为色谱纯，水为超纯水，N,N-二甲基甲酰胺为分析纯。

1.2 试药 喹烯酮对照品(含量：99.9%，批号：H0561704，中国兽医药品监察所)；空白制剂：自制复方麻黄散(取麻黄100 g，桔梗100 g，薄荷40 g，黄芪10 g，氯化铵100 g。前4味粉碎，过4号标准筛，与研成细粉的氯化铵混匀，即得。所需中药均购自正和祥药业有限公司)；供试品：复方麻黄散(批号：20200501，经检测含有喹烯酮)。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 用十八烷基硅烷键合硅胶柱为固定相；以甲醇-水(60∶40，V∶V)为流动相；流速为1.0 mL/min；进样量：10 μL；柱温30 ℃，二极管阵列检测器检测，采集波长范围为190～400 nm，分辨率为1.0 nm；记录波长314 nm处的色谱图，同时记录光谱图。

2.2 溶液配制

2.2.1 复方麻黄散制剂空白溶液 取空白制剂1.0 g，置20 mL量瓶中，加N,N-二甲基甲酰胺5.0 mL，塞上塞子，超声处理10 min，取出，放冷，加甲醇稀释至刻度，摇匀；另取2.00 mL，置20 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，作为复方麻黄散制剂空白溶液。

2.2.2 喹烯酮对照品贮备液的配制 取喹烯酮对照品约10 mg，置20 mL量瓶中，加N,N-二甲基甲酰胺5.0 mL使溶解，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得浓度为0.5 mg/mL的对照品贮备液。

2.2.3 喹烯酮对照品溶液的配制 精密量取喹烯酮对照品贮备液2 mL，置20 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得浓度为50 μg/mL的对照品溶液。

2.2.4 供试品溶液的配制 取供试品1.0 g，置20 mL量瓶中，加N,N-二甲基甲酰胺5.0 mL，塞上塞子，超声处理10 min，取出，放冷，加甲醇稀释至刻度，摇匀；另取2.00 mL，置20 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。

2.2.5 阳性添加样品溶液的配制 取制剂空白样品1.0 g，置20 mL量瓶中，按高(H)、中(M)、低(L)三个浓度水平分别加入10、8和6 mg喹烯酮，混匀，加N,N-二甲基甲酰胺5.0 mL，塞上塞子，超声处理10 min，取出，放冷，加甲醇稀释至刻度，摇匀；另取2.00 mL，置20 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，作为阳性添加样品溶液。

2.2.6 检测限溶液的配制 取制剂空白样品1.0 g，置20 mL量瓶中，分别加入0.5 mg/mL的喹烯酮对照品贮备液0.25 mL、0.5 mL和1.0 mL，混匀，加N,N-二甲基甲酰胺5.0 mL，塞上塞子，超声处理10 min，取出，放冷，加甲醇稀释至刻度，摇匀；分别另取2.00 mL，置20 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀。

2.2.7 建立光谱数据库的溶液 以喹烯酮对照品溶液作为建立光谱数据库的溶液。

2.3 方法学考察

2.3.1 专属性 通过复方麻黄散制剂空白、供试品和阳性添加样品试验排除制剂中的主要成分和辅料对被测物的干扰[8]。分别精密量取2.2.1项下的复方麻黄散制剂空白溶液、2.2.4项下的供试品溶液和2.2.5项下的高浓度水平阳性添加样品溶液各10 μL，按2.1项下的色谱条件，注入高效液相色谱仪，记录色谱图，结果见图1。结果表明，供试品与阳性添加样品色谱图中，喹烯酮峰的保留时间一致，复方麻黄散制剂空白在喹烯酮相应保留时间处无干扰峰。试验结果说明方法专属性良好。

a. 复方麻黄散制剂空白 b.供试品 c. 阳性添加样品(10 mg/g)图1 专属性考察色谱图Fig 1 The chromatogram of specific inspection

2.3.2 峰纯度和光谱相似度检查 通过供试品和喹烯酮对照品溶液试验进行峰纯度和光谱相似度检查。分别精密量取2.2.4项下的供试品溶液和2.2.3项下的喹烯酮对照品溶液各10 μL，按2.1项下的色谱条件，注入高效液相色谱仪，采集3D数据，记录光谱图(图2)。结果表明，峰纯度分析显示，供试品和对照品峰匹配(表示峰最大值处的光谱与前沿和拖尾上光谱的相似度)值均为1000(匹配值大于980可以基本确认是同一组分)，说明喹烯酮峰为单一组分。经目测比较，可知供试品和对照品光谱图一致(最大吸收波长偏差不超过2 nm)。或者，通过执行光谱跟踪把供试品和对照品的光谱图与用喹烯酮对照品溶液建立的光谱库进行匹配，相似度阈值设为980，可知供试品和对照品与喹烯酮光谱库的相似度分别为1000.00和999.98，即它们的紫外光谱一致。

2.3.3 线性关系考察 精密量取喹烯酮对照品贮备液适量，加甲醇制成2.0、5.0、10.0、25.0、50.0、100.0 μg/mL的标准曲线系列溶液，测定，每个浓度水平进样两次。以喹烯酮峰面积Y为纵坐标，相应浓度X为横坐标，绘制标准曲线。回归方程为：Y=1.1969X+0.055，R2=0.9999。结果表明，喹烯酮在2.0～100.0 μg/mL范围内线性关系良好。

2.3.4 检测限 通过对复方麻黄散制剂空白样品添加喹烯酮对照品溶液考察方法的检测限。按2.2.6项下配制检测限溶液进行测定。以光谱图未失真的最低添加浓度作为方法的检测限，即加入0.5 mg/mL喹烯酮对照品贮备液0.5 mL的制剂空白样品溶液所对应的样品的喹烯酮添加量即为方法的检测限，结果见图3。结果表明复方麻黄散制剂检查喹烯酮的检测限为0.25 g/kg。

图3 检测限溶液色谱图和光谱图Fig 3 Chromatogram and spectrum of the LOD solution

2.3.5 准确度 通过对复方麻黄散制剂空白样品添加喹烯酮对照品进行回收率试验考察方法的准确度。按2.2.5项下每个浓度水平分别平行配制3份阳性添加样品溶液，进行测定，每个平行进样2次，计算回收率，结果见表1。结果表明，复方麻黄散制剂空白样品添加喹烯酮的平均回收率为101.4%，RSD=0.5%。

表1 回收率试验结果Tab 1 The results of recovery test

2.3.6 耐用性 以高浓度水平阳性添加样品溶液作为耐用性试验溶液，改变柱温、流速、流动相比例及更换不同品牌的色谱柱(4.6×250 mm, 5 μm)四个方面考察方法的耐用性。试验结果表明，当柱温升高、流速增加、流动相中有机相比例提高时，保留时间会提前；使用相同规格性能相近的不同品牌的色谱柱时，保留时间会发生变化。但上述情况下分离度均满足检测要求，说明方法耐用性良好。

2.3.7 样品测定 按2.2.4项下配制供试品溶液进行测定。供试品溶液在与喹烯酮对照品溶液主峰保留时间一致处有色谱峰出现；峰纯度分析显示峰匹配值为1000，为单一组分。峰跟踪显示该色谱峰与标准库中喹烯酮色谱峰相似度为999.99；两者紫外光谱图及最大吸收波长均一致。故判定供试品中含喹烯酮，并测得其含量为9.3 g/kg。

3 讨论与小结

3.1 复方麻黄散制剂非法添加喹烯酮的发现 在进行兽药非法添加物筛查时，本试验使用自建方法进行检测时，发现某复方麻黄散制剂疑似添加喹烯酮，经过复方麻黄散制剂空白试验及阳性添加试验进一步得到确认。

3.2 色谱条件、提取波长和检测器的选择 本试验中采用的色谱条件和提取波长，均参照《兽药质量标准》2017年版化学药品卷喹烯酮的液相色谱含量测定方法建立，为对目标物进行准确定性，采用二极管阵列检测器检测。

3.3 提取条件的优化 本试验的提取溶剂同样参照《兽药质量标准》2017年版化学药品卷喹烯酮的液相色谱含量测定，考虑到样品基质的复杂性，故对样品超声处理10 min，确保喹烯酮被充分提取。比较而言，陆春波等[4]用甲醇提取喹乙醇预混剂中的喹烯酮，方法较简单便捷；罗成江等[5]用0.3%的磷酸溶液(取磷酸3.0 mL加水1000 mL，用三乙胺调pH值至3.0，加乙腈 50 mL)提取氟喹诺酮类药物粉剂中非法添加的喹烯酮等药物，有利于分离测定氟喹诺酮及喹噁啉类药物，有较好的适用性和针对性。

3.4 进样量的选择 试验在不改变其他色谱条件的情况下，采用喹烯酮对照品溶液作为试验溶液，分别对三款不同品牌的色谱柱进样20、10和5 μL，结果表明，进样量为20 μL时，色谱峰峰形变差，故选择10 μL作为进样量。

建立了复方麻黄散中非法添加喹烯酮的HPLC-DAD检查方法，通过专属性、线性关系、检测限、准确度、耐用性考察表明可准确定量，结合保留时间、紫外吸收光谱、峰纯度分析可准确定性识别。方法简单、快速、准确，可用于检查复方麻黄散中非法添加喹烯酮。