植物病原真菌囊泡转运相关Rab家族蛋白研究进展

谭祥宇, 陈莹, 李雨欣, 尉婧, 李二峰

(天津农学院园艺园林学院,天津 300392)

植物真菌病害是由植物病原真菌引起的病害,约占植物病害的70%～80%,种类繁多,严重危害了农作物的生产。目前,Rab蛋白已被确定与植物病原真菌的囊泡运输息息相关,并参与病原菌自身的生长发育、有性及无性生殖、毒素分泌,以及对寄主植物的致病力等,然而,相比于其在酿酒酵母、植物和哺乳动物中的研究,Rab蛋白在植物病原真菌中的功能研究仍处于初级阶段,缺少系统性。因此,为了解析各种Rab蛋白在植物病原真菌中的作用,更快更好的服务于农业生产,本研究对植物病原真菌Rab蛋白的结构特征、循环通路、上下游信号调控因子以及其生物学功能的研究进展进行了综述,以期为植物病原真菌致病机制及植物真菌病害的防治提供指导策略。

1 Rab家族蛋白概述

小GTP结合蛋白(small GTPases),又称小GTP酶/小G蛋白,相对分子质量大约为20～25 kD,因其结合鸟苷三磷酸(GTP)而得名。小GTP结合蛋白具有内源GTPase活性,起着分子开关的作用[1]。据报道,到目前为止,已有100多种小GTP结合蛋白在各种真核生物中被发现,根据序列的同源性,小GTP结合蛋白可分为Ras、Arf、Rap、Rab、Rho、Ran、Rit、Rad、Rheb和Miro等多种蛋白家族[2-3]。其中Rab家族蛋白是小GTP结合蛋白中最大的家族,在多种真核生物中普遍存在。最早被发现和鉴定的Rab蛋白是酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)中参与胞吞胞吐途径的Sec4和Ypt1蛋白[4-5]。由于哺乳动物第一个Rab蛋白是从小鼠大脑的cDNA文库中克隆得到的,因此该蛋白被命名为Rab(Ras-like proteins in brain)蛋白[6]。

研究表明,Rab家族蛋白主要调控囊泡出芽后的一系列过程,如囊泡沿细胞骨架的主动转运、囊泡与受体膜的初始识别和锚定,以及囊泡与受体膜融合的调剂过程等[7]。因此,在众多与囊泡运输有关的蛋白中,Rab家族蛋白是迄今为止发现的最为重要的相关蛋白之一,在真核生物囊泡形成和运输中起着重要的调节作用。

在哺乳动物中,细胞中的Rab蛋白通过介导包裹蛋白的囊泡在细胞器间的转运,来发挥自身的生物学功能[8]。Rab蛋白的异常表达会引起其介导的蛋白功能及信号通路紊乱,致使肿瘤、免疫系统疾病及神经退行性病变等相关疾病的发生[9-12];在高等植物中,不同基因组中Rab亚家族的基因序列相对保守,主要通过调节植物的生长发育、囊泡运输、植物激素的信号转导以及植物对生物和非生物胁迫的响应来发挥功能[13-16],但其详细的调控机制还在研究中;在真菌领域,Rab蛋白在酵母中研究较为深入,近几年在植物病原真菌中也取得了一系列的进展。至今在酿酒酵母中发现的Rab家族蛋白主要有Sec4、Ypt11、Ypt10、Ypt8、Ypt7、Ypt6、Ypt5、Ypt4、Ypt3和Ypt1等[17],由于Rab蛋白具有保守的结构域,利用生物信息学的方法,在植物病原真菌中也鉴定出多种Rab家族蛋白,其中禾谷镰刀菌(Fusariumgraminearum)中发现有11个假定的Rab蛋白[18],禾谷炭疽菌(Colletotrichumgraminicola)中共预测有10个Rab蛋白候选基因[19],在果生炭疽菌(C.fructicola)中共预测得到10个Rab蛋白序列[20]。

2 植物病原真菌Rab蛋白

2.1 植物病原真菌Rab蛋白的结构特征

Rab蛋白的一级结构通常由G结构域(G1～G5)、RabF模体(RabF1～RabF5)、RabSF模体(RabSF1～RabSF4),以及C端的半胱氨酸模体(C motif)这几个重要区域构成。其中,G结构域(G1～G5)在整个Rab家族蛋白成员中都具有高度保守性,是GTP结合和水解的区域,其二级结构由5个α螺旋、6个β片层和5个多肽环组成,并与Mg2+相连。G结构域中的G2和G4-a2-G5是Rab蛋白与其调控因子相互作用的位点,其构象可发生变化,故称为分子开关区域(switch I和switch Ⅱ)[21]。RabF模体(RabF1～RabF5)是Rab家族蛋白所特有的5个保守的氨基酸序列,利用该模体能够较为准确鉴别Rab蛋白。而RabSF序列则可以划定各个Rab亚家族蛋白的成员,在Rab亚家族蛋白内部比整体序列具有更高的一致性[22]。此外,Rab蛋白C端具有膜定位信号,序列常见为XXXCC、XXCCX、XCCXX、CCXXX或XXCXC,当C端的半胱氨酸被异戊二烯化修饰后,Rab蛋白则会通过C端与膜相连。

2.2 植物病原真菌Rab蛋白循环通路

Rab蛋白在胞质和其相应的囊泡之间进行周期性的循环。新合成的Rab蛋白与Rab护送蛋白(REP)结合,在Rab geranylgeranyl transferase(RabGGT)的作用下,Rab蛋白的C端会被异戊二烯化修饰。REP将修饰后的Rab蛋白传递到靶膜上,形成GDP-Rab蛋白,此时Rab蛋白处于失活状态。随后,鸟嘌呤核苷酸交换因子(GEF)作用于靶膜上的Rab蛋白,催化GDP与GTP的交换,从而激活Rab蛋白。被激活的Rab蛋白与下游效应因子相互作用,在转运过程中发挥相应的生物学功能。接下来,激活态的Rab蛋白与GTP酶激活蛋白(GAP)相互作用,GAP催化Rab蛋白水解,使Rab蛋白由GTP结合态转化为GDP结合态,释放Pi,从而使Rab蛋白失去活性。此时,鸟嘌呤核苷酸解离抑制因子(GDI)会将失活的Rab蛋白从膜上解离,并与之结合。Rab蛋白与GDI结合后,通过GDI置换因子(GDF)的作用,GDI与GDP结合态的Rab蛋白分离。最后,Rab蛋白将重新插入到靶膜,开始新一轮的循环[23-29]。

在真核生物中,蛋白质先在内质网合成,经过高尔基复合体修饰后,通过囊泡被运送到细胞的各个部位才能发挥作用。Rab家族蛋白在囊泡的形成和运输中发挥重要作用,是细胞内囊泡运输的重要分子开关。不同的Rab蛋白被其上游的调控因子激活后发挥功能,并与特定的下游效应因子互相作用,从而参与囊泡运输过程的不同阶段。除此之外,Rab蛋白作用的发挥还需要Rab蛋白与它的特定靶膜相结合。

2.3 植物病原真菌Rab蛋白调控通路

Rab蛋白行使功能需要上游调节因子和下游效应因子共同作用。Rab蛋白的上游调控因子主要调控Rab蛋白的活性,下游效应因子则是Rab蛋白发挥具体功能必不可少的协同者[30]。

2.3.1 植物病原真菌Rab蛋白的上游调控因子

根据Rab蛋白循环通路的解析可知,Rab蛋白循环过程中起主要作用的调控因子有Rab护送蛋白(REP),鸟嘌呤核苷酸交换因子(GEFs),GTP酶激活蛋白(GAPs),鸟核苷酸解离抑制因子(GDIs)及GDI解离因子(GDF)5种,每种调控因子都在Rab蛋白循环中发挥不可或缺的作用。

在酵母中对Mon1和Ccz1基因的研究表明,这2个基因在液泡的同型融合和调控囊泡运输过程中发挥重要作用[31-33]。基于前人的研究基础,LI等[34]利用基因敲除、酵母双杂交和GST-pull down等分子生物学技术,发现在禾谷镰刀菌中,Ccz1-Mon1蛋白复合物是Rab7的鸟嘌呤核苷酸交换因子(GEF),证实了FgMon1与FgRab7相互作用,并证明FgMon1和FgRab7是调节囊泡运输,内吞作用和自噬的关键成分,从而影响禾谷镰刀菌的生长发育,致病性和脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON毒素)的产生。为了探究Rab5-Mon1-Rab7调控网络在禾谷镰刀菌囊泡运输过程中的作用,李颖等[35]进行了基因敲除、亚细胞定位、酵母双杂交和GST-pull down等一系列相关试验,结果表明FgMon1可能与FgRab5A、FgRab5B、FgRab7组成一个复合调控网络,共同调控囊泡运输、胞吞作用和细胞自噬,进而影响禾谷镰刀菌的生长发育、毒素产生和致病性。

YANG等[36]通过基因敲除、亚细胞定位、qRT-PCR以及酵母双杂交试验表明,FgVps9作为FgRab51和FgRab52的GEF来调节内吞作用,对禾谷镰刀菌的营养生长、无性发育、自噬、DON毒素产生和侵染植物有显著影响。而在稻瘟病菌(Magnaportheoryzae)中,何晓娟[37]利用基因敲除和酵母双杂技术对Vps9基因的功能及Vps9a与MoYpt5的互作关系进行了系统研究,发现MoVps9a敲除突变体生长缓慢,产孢量下降,致病性减弱,菌丝内部呈现出许多小液泡,MoVps9a分别与处于DN(dominant negative:通过基因突变改变氨基酸的性质,使之持续失活)状态的MoYpt51和MoYpt52互作,而不与CA(constitutively activate:通过基因突变改变氨基酸的性质,使之持续激活)状态的MoYpt51和MoYpt52结合,说明MoVps9a有可能是稻瘟病菌中MoYpt51/52的鸟嘌呤核苷酸交换因子。此外,郭伟艺[38]对稻瘟病菌MoSec2进行基因敲除及表型观察,发现MoSec2可能是MoSec4的GEF蛋白,并能调节MoSec4的活性,从而调控稻瘟病菌的生长发育、孢子产生和致病力,为进一步阐明MoSec4的作用机制奠定基础。

ZHENG等[39]通过基因敲除、表型观察和GTP酶活性测定发现FgGyp1是FgRab1的GTP酶激活蛋白(GAP),对禾谷镰刀菌的营养生长、分生孢子产生和致病力至关重要,并负调节禾谷镰刀菌中DON毒素的生物合成。此外,ZHENG等[40]利用基因敲除技术和结构域缺失载体构建进行基因功能研究,结果表明,FgGyp8是营养生长、分生孢子发生、致病性所必需的,能够催化FgRab1上的GTP水解为GDP,表明FgGyp8是FgRab1的GTP酶激活蛋白(GAP),并发现它与FgGyp1功能冗余。李玲萍等[41]为研究Rab GTP酶调控网络,从SMART数据库中鉴定了禾谷镰刀菌所有含有TBC结构域的12个假定GAPs,对这个蛋白家族的基因进行敲除、亚细胞定位和表型分析。结果显示,FgMSB3主要定位于菌丝顶端,该基因缺失导致突变体生长变慢,对小麦麦穗的致病力基本丧失,同时在遗传上证实了FgMsb3可作为FgRab8的GAP发挥功能。

2.3.2 植物病原真菌Rab蛋白的下游效应因子

Rab蛋白通过与下游各种效应蛋白的相互作用来调节各自的转运途径。一些可溶性的效应因子被激活态的Rab蛋白招募后,将GTP信号传递给下游的效应蛋白,且每个Rab蛋白可以和多个效应因子互作,从而调控囊泡转运的不同过程[42-44]。

目前,关于植物病原真菌Rab蛋白下游效应因子的研究缺少详细报道,其中涉及Retromer复合体和HOPS复合体的内容相对较多。在酿酒酵母中,Retromer是1个由Vps26、Vps29、Vps35共3个大亚基和Vps5、Vps17共2个小亚基组合形成的蛋白复合体;HOPS则是1个六亚基复合体,由Vps11、Vps16、Vps18、Vps33、Vps39和Vps41组成[45]。

王亚君[46]利用酵母双杂交技术对禾谷镰刀菌FgRab7的互作蛋白进行研究,结果表明,Vps26是Rab7的一个效应因子,FgRab7通过与Vps26的相互作用调控DON毒素的生物合成,揭示了Rab7调控病原菌DON毒素合成的分子机制;孟瑶[47]通过酵母双杂交和qRT-PCR研究发现Rabring7是Rab7的效应因子,Rabring7在禾谷镰刀菌的DON毒素合成、对胁迫的敏感性、致病性等方面具有调控作用,为揭示禾谷镰刀菌的致病机制和DON毒素合成的分子调控机制奠定了基础。LI等[48]利用酵母双杂交和双分子荧光互补检测技术发现禾谷镰刀菌HOPS复合体的亚基FgVps41是FgRab7的效应因子,其对病原菌的生长发育、分生孢子形态、DON毒素产生及致病力均起重要作用。

此外,在稻瘟病菌中,李忠春[49]通过基因敲除、表型分析和酵母双杂交发现MoYIP3可能是MoRab51的效应因子。试验证明,MoYIP3与MoRab51的CA(GTP结合状态)和DN(GDP结合状态)状态下均不互作,推测该蛋白虽不与MoRab51直接互作,但它的表达可能受到MoRab51的调控,从而参与了MoRab51的信号传导与物质运输。而吴淙贤[50]利用基因敲除、表型分析和免疫共沉淀技术进行试验,推测稻瘟病菌Retromer复合物核心成员MoVPS35可能是MoYPT7的效应因子,Co-IP试验结果证实,稻瘟病菌中MoYpt7和MoVps35存在互作关系,并使MoVps35与晚期内涵体结合,且MoYpt7两种不同结合状态蛋白MoYpt7-CA和MoYpt7-DN都能和MoVps35互作,但MoVps35可能不是作为MoYpt7的效应蛋白发挥功能。张晓杰等[51]利用基因敲除、亚细胞定位和转录组测序等技术对稻瘟病菌HOPS复合体进行研究,并构建了ΔMoVps41缺失突变体,结果表明,在ΔMoVps41突变体中找不到GFP-MoYpt7在液泡膜的定位,也没有明显的液泡形态,即在MoVps41缺失的情况下,液泡融合受阻,说明稻瘟病菌中HOPS复合体与MoYpt7可能在功能上有互作关系。

2.4 植物病原真菌Rab蛋白的功能

真菌常见的Rab家族蛋白主要由Ypt1、Ypt3、Ypt5、Ypt6、Ypt7和Sec4组成,各蛋白在细胞内的定位和功能不同。Ypt1在分泌途径的早期调控囊泡从内质网向高尔基体的转运;Ypt3参与深层次的胞吞作用;Ypt5负责将蛋白质从高尔基体和质膜运输到内涵体;Ypt6调控蛋白质从高尔基体向内质网及高尔基体内的运输;Ypt7蛋白介导液泡融合;Sec4则主要参与极性生长和相关分泌途径,介导来源于TGN(顺面高尔基体网状膜囊)的囊泡进入芽体[42]。

除此之外,植物病原真菌Rab家族蛋白的表达也参与指导病原菌自身的各种表型特征。研究报道,在多种植物病原真菌中,Rab家族蛋白均与菌丝的形态及生长速率、分生孢子产量及孢子萌发率、致病性、毒素产生等息息相关。

YUAN等[52]利用重叠延伸PCR构建禾谷镰刀菌FgRab1(Rab1/Ypt1同源基因)缺失突变体,并对其进行亚细胞定位和表型分析,研究表明,该基因定位于高尔基体、内质网和菌丝尖端,与野生型相比,禾谷镰刀菌ΔFgRab1营养生长减弱、细胞壁厚度增加、菌丝分枝增多,致病力减弱。

齐尧尧等[53]用同源重组的方法对禾谷炭疽菌CgRab4(Rab4/Ypt4同源基因)进行基因敲除,结果表明,基因缺失促进菌丝生长,但不影响菌丝形态,且不参与对外界胁迫响应的调控,突变体菌株的分生孢子形态和产量、附着胞的产生以及对玉米的致病力都没有显著变化。

PENALVA等[54]对构巢曲霉(Aspergillusnidulans)RabB(Rab5/Ypt5同源蛋白)的功能进行了基因敲除、亚细胞定位、GST-pull down等研究,结果表明,RabB调控早期内涵体的降解过程,并协调早期内涵体向高尔基体的运输、长距离转运以及早期内涵体向晚期内涵体的成熟过程。杨文晟[55]对荔枝霜疫霉(Peronophythoralitchii)PlRAB5A(Rab5/Ypt5同源基因)进行基因敲除、亚细胞定位及一系列表型研究,结果表明,PlRAB5A定位于囊泡膜和初级内涵体上,可能在整个荔枝霜疫霉生活史中均行使功能,在孢子囊阶段更加重要,而在休止孢萌发阶段相对较弱,且敲除突变体生长速率显著降低,菌丝形态出现不规则膨大且隔膜增多,释放的游动孢子数降低,致病力显著降低。在大豆疫霉(Phytophthorasojae)中进行基因沉默和表型分析,结果表明,PsVPS21(Rab5/Ypt5同源基因)缺失突变体的生长速率显著降低,产孢量下降,休止孢萌发形态异常,菌丝呈现多分支、顶端和分支处膨大,细胞壁成分的分布明显发生改变,缺失突变体致病性降低,胞外蛋白分泌显著减少,对内质网的压力也更加敏感[56]。

OHSUMI等[57]发现,构巢曲霉avaA(Rab7/Ypt7同源基因)基因缺失突变体导致菌株液泡高度碎片化,该基因过表达严重抑制菌丝生长,并导致液泡异常肿胀。在稻瘟病菌中构建绿色荧光蛋白载体进行亚细胞定位,MoYpt7(Rab7/Ypt7同源蛋白)主要定位于液泡膜,敲除MoYPT7基因后,突变体的分生孢子畸形,不能形成附着胞,不具有致病性,且表现出自噬损伤、破坏细胞壁完整性以及对钙和重金属胁迫更高的敏感性[58]。在果生炭疽菌中进行基因敲除和一系列表型观察,结果显示突变体ΔCfrab7(Rab7/Ypt7同源基因)的菌落直径显著减小,产孢量和附着孢显著减少,不能穿透玻璃纸,H2O2胁迫下生长受到明显抑制;进一步研究发现突变体ΔCfrab7液泡无法正常融合,对油茶的致病力显著下降[59]。张小龙等[60]通过基因敲除和表型观察对苹果树腐烂病菌(Valsamali)进行研究,结果表明,VmRAB7(Rab7/Ypt7同源基因)基因的缺失使菌丝生长速率降低了约40%,致病力降低了约50%,突变体丧失了产孢能力,ΔVmrab7敲除突变体具有小且多的碎片化液泡,液泡中无球状的自噬体结构。在禾谷镰刀菌中进行FgRab7基因敲除和表型观察后发现,与野生型相比,缺失FgRab7基因导致菌株生长速度减慢,产孢量明显下降,并且敲除FgRab7菌株的DON毒素合成量显著降低[61-62]。

ZHANG等[63]利用基因敲除、Southern blot、qRT-PCR等技术进行研究,发现灰霉病菌(Botrytiscinerea)Bcsas1(Rab8/Sec4同源基因)突变体抑制了病原菌菌丝发育和孢子形成,降低了对寄主番茄、苹果等的毒力,并显著抑制多糖水解酶和蛋白酶的分泌。POWERS等[64]在烟曲霉(A.fumigatus)中研究了Sec4的同源蛋白SrgA(Rab8/Sec4同源蛋白),亚细胞定位结果显示,GFP-SrgA融合蛋白优先在菌丝尖端和成熟的分生孢子梗处积累,突变体的表型试验显示,ΔSrgA菌丝生长速率受到抑制,并导致分生孢子梗畸形,分生孢子形态异常,且SrgA突变体的每个分离株(A/B/C)显示出不同的耐热性、体外应激反应和致病性。黄彩敏等[65]利用同源重组方法构建了大丽轮枝菌(Verticilliumdahliae)VdSec4(Rab8/Sec4同源基因)敲除突变体,分别以纤维素、果胶为单一碳源进行鉴定,发现突变体菌株较野生型的生长能力延缓,暗示突变体果胶酶、纤维素酶等胞外蛋白的分泌能力受限,并利用蛋白定量技术(iTRAQ)比较了突变体菌株和野生型菌株的胞外蛋白谱,发现有332个蛋白因VdSec4缺失无法分泌,且突变体菌株对寄主棉花的致病力显著下降。而在辣椒疫霉中(P.capsici)进行了基因敲除和表型分析试验,结果表明,敲除Sec4同源基因后辣椒疫霉菌丝生长受到一定程度的抑制,但游动孢子产量和休止孢萌发无明显影响,致病力显著下降,初步推测辣椒疫霉中Sec4同源基因可能与辣椒疫霉的致病力相关[66]。

3 展望

Rab家族蛋白是真核生物中一类具有重要生物学功能的蛋白,研究数据表明,植物病原真菌中的Rab蛋白对其自身生命活动和对寄主植物的寄生致病非常重要,并能与其上下游信号因子互作,通过Rab蛋白循环途径不断地发挥功能。到目前为止,对植物病原真菌Rab蛋白的功能研究已取得了一定的进展,但植物病原真菌中仍然缺少系统性的针对Rab蛋白家族的研究,每种Rab蛋白的上下游信号调控因子尚未完全解析,此外,植物病原真菌中的Rab蛋白能否与寄主植物直接互作,或Rab蛋白是否能通过调控效应蛋白的分泌从而引发植物免疫反应等问题仍未涉及。加深对植物病原真菌中Rab蛋白家族功能的了解,将更加有利于多角度解析多种植物病原真菌的致病机制,为制定合理的病害防治策略提供理论指导意义。