泛素化与SUMO化修饰在脱落酸信号转导中的调控作用研究进展

崔晓娜,陈美君,曹园园,周舒浩,李潇楠,张海荣

(河南农业大学生命科学学院,河南 郑州 450046)

脱落酸(abscisic acid,ABA)是广泛存在于高等植物中的经典植物激素。ABA调控植物种子萌发与休眠、幼苗根的生长和气孔运动等过程,进而参与植物对干旱、盐、渗透等胁迫的响应。ABA信号通路基因功能异常会改变植物对逆境胁迫的敏感程度[1-3]。因此,研究ABA信号转导通路中各基因的表达调控可为抗逆作物的培育、农作物产量的增产和品质的改良提供理论依据。

目前,蛋白质的磷酸化、泛素化和SUMO化(small ubiquitin-like modifier)等多种蛋白质翻译后修饰对ABA信号的调控机制已被揭示。其中,泛素分子和SUMO分子有相似的三维结构,并且都修饰蛋白质的赖氨酸残基,进而影响蛋白质的稳定性[4]。因此,重点阐述这2种相似的翻译后修饰在ABA信号转导通路中的调控作用,并讨论二者之间的调控关系,旨在为筛选抗逆农作物提供思路。

1 ABA信号转导通路

目前,ABA的核心信号转导通路元件主要包括ABA的特异识别受体PYR1(pyrabactin resis-tance 1)/ PYL(PYR1-like)/ RCAR(regulatory component of ABA receptor)、下游的蛋白磷酸酶PP2Cs(protein phosphatase 2Cs)和蛋白激酶SnRK2s (SNF1-related protein kinase 2s)。拟南芥(Arabidopsisthaliana)的ABA受体有14个成员,分别为PYR1和PYL1～PYL13;拟南芥PP2C家族成员超过80个,其中A亚家族的9个成员参与ABA信号转导,即ABI1(ABA insensitive 1)、ABI2(ABA insensitive 2)、HAB1(homology to ABI1)、HAB2(homology to ABI2)、AHG1(ABA-hypersensitive germination 1)、AHG3(ABA-hypersensitive germination 3)和HAI1-3(highly ABA-induced 1-3);拟南芥的SnRK2蛋白激酶家族有10个成员,即SnRK2.1～SnRK2.10,其中SnRK2.2、SnRK2.3和SnRK2.6/OST1(open stomata 1)起主要作用。ABA的核心信号通路为ABA受体PYR1/PYLs/RCARs首先识别ABA,然后与蛋白磷酸酶PP2Cs相互作用,使PP2Cs释放被抑制的蛋白激酶SnRK2s;而SnRK2s被磷酸化激活后进一步磷酸化下游的靶蛋白,调节ABA应答基因的表达[5]。

2 ABA信号转导中泛素化修饰

泛素(ubiquitin,Ub)是广泛存在于真核生物中的一类多肽,由76个氨基酸组成。泛素化修饰会影响蛋白质的活性、亚细胞定位、组装、稳定性及与其他蛋白的相互作用。蛋白质的泛素化修饰过程需要E1泛素激活酶(ubiquitin-activating enzyme,UBA)、E2泛素结合酶(ubiquitin-conjugating enzyme,UBC)和E3泛素连接酶(ubiquitin ligase,UBL)。首先E1泛素激活酶激活泛素分子,然后泛素分子被E1泛素激活酶转移给E2泛素结合酶,形成E2-Ub复合体,最后由负责特异性识别底物的E3泛素连接酶与E2泛素结合酶共同将泛素分子转移到靶蛋白上。泛素化修饰是可逆的,由去泛素化酶(deubiquitinating enzymes,DUBs)水解释放被修饰的蛋白质上的泛素分子。

泛素化修饰对底物选择的特异性主要是由E3泛素连接酶决定的,因此,E3泛素连接酶在泛素化修饰过程中起关键作用,在ABA信号通路的调控中也被研究最多。E3泛素连接酶是一个非常庞大的蛋白家族,可以分为单亚基E3连接酶和多亚基E3连接酶复合体2种类型。单亚基E3连接酶包括RING型(really interesting new gene)、U-box型、HECT型(homology to E6-associated carboxy-terminus)和RBR型(ring between ring)。多亚基E3连接酶复合体包括CRLs(Cullin-RING ligases)家族和APC复合体。CRLs在结构上由Cullin脚手架蛋白(Cul1、Cul3a/3b或Cul4)、RBX1(RING box-1)蛋白和识别结合底物的底物受体蛋白组成。Cul1型的CRL指的是SCF(SKP1-Cullin-F box)复合体,其中F box蛋白是底物受体蛋白,负责招募底物,决定E3泛素连接酶的特异性。除了F box蛋白以外,底物受体蛋白还包括BTB(bric-a-brac-tramtrak-broad)、DDB(damaged DNA-binding protein)等[6]。因此,对ABA信号通路中各元件的泛素化修饰研究进行概括和讨论。

2.1 ABA受体蛋白的泛素化修饰

拟南芥中最早被报道的被泛素化修饰的ABA受体蛋白是PYL4、PYL8和PYL9。DDA1(DET1- and DDB1-associated 1)参与其泛素化修饰。DDA1属于CDD(COP10-DET1-DDB1)底物受体复合体的一部分,也是基于Cullin4的E3泛素连接酶复合体的组分。DDA1基因过表达植株对ABA敏感程度下降,而CDD复合体组分的相关功能缺失突变体都表现出对ABA超敏感的表型,表明DDA1负调控ABA信号通路。DDA1与ABA受体PYL8、PYL4、PYL9在细胞核中相互作用,并促进PYL8的泛素化,从而使其被蛋白酶体降解。ABA抑制DDA1对PYL8的泛素化降解,从而保护PYL8的活性[7]。这一机制解释了ABA的存在能够保证相关信号转导正常进行的原因。

除PYL8以外,调控PYR1和PYL4受体泛素化修饰的E3泛素连接酶也被鉴定出来,即RING型E3泛素连接酶RSL1(ring finger of seed longevity 1)[8]。RSL1基因的过表达植株对ABA的敏感性降低,而RSL1基因的RNAi(RNA interference)植株则表现出对ABA超敏感的表型,表明RSL1是ABA信号通路的负调控因子。RSL1与PYR1、PYL4直接相互作用介导其泛素化降解。但是与DDA1不同,RSL1与PYL1、PYL4共定位在质膜上而非细胞核中。RSL1用囊泡运输的抑制剂BFA(brefeldin A)处理后,能够增强其在膜上的共定位,因此推断RSL1主要负责调控质膜上的ABA受体蛋白的稳定性,并且影响其囊泡运输[8]。

被泛素化修饰的蛋白质大多通过26S蛋白酶体途径进行降解,也可以通过内涵体介导的囊泡运输途径进入液泡或溶酶体中进行储存或降解[9-10]。ESCRTs(endosome sorting complex required for transports)在蛋白分选进入MVB(multivesicular body)内部囊泡方面发挥功能。YU等[11]和BELDA-PALAZON等[12]发现RSL1泛素化PYR1和PYL4后,不是通过蛋白酶体而是通过囊泡运输到液泡中进行降解。ESCRT-I的组分FYVE1/FREE1(FYVE domain protein required for endosomal sorting 1)能够与RSL1-PYL4复合体相互作用,将PYL4招募到内涵体中,进入液泡进行降解。fyve1突变体中积累较高水平的PYL4蛋白,因此,对ABA超敏感[12]。泛素E2-like蛋白VPS23A(vacuolar protein sorting 23A)也是ESCRT-I复合体的一个关键组分,同FYVE1/FREE1一样负调控ABA信号通路,其突变体表现出对ABA超敏感的表型。VPS23A可以识别ABA受体及其K63位泛素链,促进其进入囊泡运输途径从而影响其的亚细胞定位和稳定性[11]。总之,FYVE1和VPS23A作为且ESCRTs复合体组分都可以识别结合被泛素化修饰的蛋白,但是两者之间的协同作用还有待研究,且ESCRTs复合体中的其他组分的功能也是未来研究的内容。此外,拟南芥中还存在VPS23A的同源蛋白VPS23B,两者在ABA与胁迫应答过程中是否存在功能冗余也有待揭示。

随着研究的深入,VPS23A和FREE1的上游调控元件也被鉴定出来。SINAT1(seven in absentia ofArabidopsisthaliana1)、SINAT2、SINAT3和SINAT4等4个E3泛素连接酶能够调控VPS23A和FREE1的泛素化和蛋白酶体降解,进而降低其稳定性,从而正调控ABA信号。SINATs基因的过表达植株中PYL4受体的蛋白水平和ABA应答基因的表达水平都比野生型高,并表现出对ABA敏感度升高的表型[13]。RING型E3泛素连接酶XBAT35(E3 ligase XB3 ortholog 5 inArabidopsisthaliana)也可以催化VPS23A发生泛素化,进而被蛋白酶体降解。xbat35突变体中PYL4受体蛋白的水平低,并在种子萌发和根伸长方面都对ABA不敏感,且不耐干旱胁迫,而VPS23A功能缺失能恢复xbat35突变体的表型。由此可见,XBAT35通过降解VPS23A提高ABA受体PYL4的水平,进而正调控ABA信号[14]。与SINATs和XBAT35相反,2个参与去泛素化的泛素蛋白酶UBP12(ubiquitin-specific protease 12)和UBP13负调节ABA信号,并通过催化VPS23A蛋白的去泛素化,提高其稳定性,进而促进ABA受体的降解。VPS23A基因过表达能恢复ubp12-2w或ubp13-1突变体对ABA超敏感和对干旱不敏感的表型[15]。UBP12和UBP13还可以催化E3泛素连接酶XBAT35的去泛素化,进而稳定XBAT35蛋白。XBAT35与VPS23A竞争结合UBP12和UBP13,精细调控VPS23A的泛素化降解[15-16]。总之,E3泛素连接酶SINATs、XBAT35与泛素蛋白酶UBP12、UBP13通过调控VPS23A的降解,间接地调节ABA受体PYL4蛋白水平,参与ABA信号转导。

除了E3泛素连接酶,参与ABA受体泛素化修饰的E2泛素结合酶也被鉴定出来。拟南芥中有37个具有活性的E2泛素结合酶[17]。其中,UBC26能直接结合PYL4,调节PYL4的泛素化降解,从而负调控ABA信号,当然这一过程仍需要RING型E3泛素连接酶RFA1(RING finger ABA-related1)和RFA4共同参与[18]。一般认为,在泛素修饰过程中E3泛素连接酶直接识别结合底物,而E2泛素结合酶只是作为桥梁将泛素分子与E3-底物复合体联系起来,并不与底物直接相互作用。这使研究者对E2泛素结合酶的作用方式有了新的认知。

2.2 PP2C蛋白磷酸酶的泛素化修饰

ABI1是PP2C家族的成员。KONG等[19]发现,用26S蛋白酶体抑制剂MG132处理拟南芥幼苗后,ABI1蛋白的水平明显高于对照。这表明ABI1可以被26S蛋白酶体降解。酵母双杂交筛选出了一些与ABI1互作的U-box型E3连接酶PUBs(plant U-box E3 ligases),通过蛋白互作验证确定了其中的2个成员PUB12和PUB13与ABI1相互作用。生化试验证明,PUB12与PUB13参与了ABI1的泛素化修饰及降解[19]。拟南芥PP2C家族A亚家族有9个成员参与ABA信号转导,除了ABI1以外,其他的PP2C家族成员也有可能被不同的E3泛素连接酶调节。

随后,AHG3、ABI2和HAB2等另外3个PP2C蛋白的泛素化调节机制也被揭示。RING型E3泛素连接酶家族中RGLG1(RING domain ligase 1)和RGLG5参与3个PP2C蛋白的泛素化降解从而正调控ABA信号。在这个过程中ABA起促进作用。rglg1、rglg5双突变体在种子萌发和萌发后阶段都表现出对ABA敏感程度降低,以及对干旱胁迫敏感的表型,而RGLG1和RGLG5基因的过表达植株则比野生型更加耐干旱胁迫[20]。JULIAN等[21]发现,E3泛素连接酶CRL3s(Cullin3-RING-based E3 ligases)的BPM(BTB/POZ and MATH domain proteins)亚基BPM3和BPM5也可以与ABI1、ABI2和HAB1等PP2C蛋白磷酸酶相互作用,调控泛素化修饰。bpm3和bpm5双突变体能积累更多的PP2C蛋白,并表现出对ABA敏感度降低的表型。

总之,虽然已知一些PP2C受泛素化调控,其上游的E3泛素连接酶也被鉴定出来,但是其他参与ABA信号转导的PP2C蛋白是否也受泛素化修饰调控及其机制还不清楚。此外,PP2C的活性受到ABA受体的调控,而ABA受体蛋白的稳定性在细胞膜和细胞核中由不同的E3泛素连接酶调节[7-8]。目前,已知BPM3、BPM5与PP2Cs在细胞核中共定位,而PUB12可能定位于细胞膜上。因此,PP2C蛋白的稳定性可能也有类似的调节机制。

2.3 SnRK2s蛋白激酶的泛素化修饰

研究发现,ABA信号通路中的关键激酶SnRK2也被泛素化修饰调节。AtPP2-B11是SCF(SKP1/Cullin/F-box)E3泛素连接酶复合体中的F-box蛋白。AtPP2-B11基因敲除突变体在种子萌发和萌发后阶段都表现出对ABA超敏感的表型,其过表达植株虽然没有表现出对ABA敏感程度的降低,但是能够抑制SnRK2.3基因过表达植株对ABA超敏感的表型,表明AtPP2-B11是ABA信号通路负调控因子。同时,AtPP2-B11能够泛素化修饰SnRK2.3,并促进其被26S蛋白酶体降解[22]。虽然SnRK2.2和SnRK2.6/OST1也被蛋白酶体降解[22],但是AtPP2-B11并不影响其稳定性,因此,AtPP2-B11不是调控两者的泛素连接酶。

ALI等[23]鉴定出HOS15(high osmotic stress 15)能促进SnRK2.6/OST1发生泛素化修饰,进而被26S蛋白酶体降解。HOS15是CUL4-DDB1 E3泛素连接酶复合体中的底物受体蛋白。hos15突变体中OST1蛋白的稳定性增强,对ABA超敏感,对干旱胁迫有很强的耐受性。OST1功能缺失能明显抑制hos15对干旱敏感的表型。同时,ABA抑制HOS15与OST1相互作用,从而增强OST1的稳定性,而ABI1和ABI2能够通过去磷酸化OST1促进HOS15-OST的互作,进而泛素化降解OST1。生化数据结合数学模型预测发现,ABA可以通过OST1增强ABI1/ABI2的表达,从而与上述过程形成完整的反馈调节环,即OST1促进ABI1/ABI2表达,而ABI1/ABI2反过来又促进OST1的泛素化降解[23]。这表明植物可通过调控SnRK2蛋白激酶的稳定性来调节ABA信号通路,但HOS15如何被激活从而诱导OST1的降解,以及ABI1/ABI2如何稳定HOS15-OST1复合体的形成仍需进一步探究。

2.4 ABA转录因子的泛素化修饰

ABI3(abscisic acid-insensitive 3)是ABA信号转导通路中的一个具有B3结构域的转录因子,能够被蛋白酶体降解[24]。ZHANG等[24]和KURUP等[25]发现,RING型E3泛素连接酶AIP2(ABI3-interacting protein2)与ABI3相互作用,调节其泛素化修饰及稳定性。AIP2是ABA信号通路的负调控因子,在AIP2基因过表达植株中,ABI3蛋白水平降低,表现出与abi3突变体类似的表型,即对ABA敏感程度下降,与其相反,在aip2突变体中积累了较高水平的ABI3蛋白,表现出对ABA超敏感的表型,与ABI3基因过表达植株表型一致[24-25]。另一个被揭示的可能调控ABI3泛素化的E3连接酶是定位于细胞核中的U-box型E3泛素连接酶PUB9(plant U-box 9)。遗传学证据表明,PUB9是ABA信号的负调控因子,其突变体在种子萌发和根的伸长方面都对ABA超敏感,并且PUB9位于ABI3上游发挥功能。PUB9同样还受到ABA的调控,ABA处理后其定位从细胞核转移到质膜上,可能会影响其发挥功能[26]。总之,AIP2和PUB9这2个E3泛素连接酶位于ABI3上游调控ABI3的稳定性,但是目前仅有遗传学证据表明PUB9位于ABI3上游发挥功能,还没有明确的生化证据证明ABI3是PUB9的直接底物。

bZIP转录因子ABI5(abscisic acid-insensitive 5)也受泛素化修饰调节并被蛋白酶体降解[27-31]。RING型E3泛素连接酶KEG(keep on going)参与ABI5的泛素化修饰,是ABA信号通路的负调节因子,其突变体对ABA超敏感,ABI5基因功能缺失能部分恢复keg突变体的表型。KEG蛋白通过其锚蛋白(ankyrin,ANK)重复序列与ABI5的C3结构域相互作用,催化其344位赖氨酸发生泛素化修饰,进而被蛋白酶体降解,这一过程发生在细胞质中[29-30]。但是当ABA存在时,KEG自身也能被泛素化修饰并被蛋白酶体降解,从而解除对ABI5的负调控作用[32]。ABI5的C3结构不但是与KEG互作的位点,也是核定位所必需的,而KEG促进细胞质中的ABI5泛素化降解,至于细胞核内的ABI5是被哪个E3泛素连接酶调控仍未知[29]。ABI5还受到E3泛素连接酶的间接调控。SDIR1(salt-and drought-induced really interesting new gene finger 1)是位于内质网膜上的RING型E3泛素连接酶,是ABA信号通路的正调控因子,能够泛素化SDIRIP1(SDIR1-interacting protein 1)使其被26S蛋白酶体降解,进而上调ABI5基因的转录水平[33-34]。虽然遗传学证据表明除了ABI5以外,其他bZIP转录因子如ABF3(ABRE binding factor 3)和ABF4也位于SDIR1的下游,但是SDIRIP1只特异调控ABI5的表达,SDIR1是否通过SDIRIP1以外的底物间接调控ABF3和ABF4等转录因子的表达仍不清楚。另外,SDIR1-SDIRIP1-ABI5调控模型能够阐明SDIR1参与盐胁迫响应的机制,并未揭示SDIR1如何参与干旱胁迫应答的。

R2R3型转录因子也参与ABA信号通路并参与渗透、干旱和盐等逆境胁迫,包括MYB20、MYB30和MYB96等[35-37],其中,MYB30是ABA信号通路的负调节因子。RING型E3泛素连接酶RHA2b(RING-H2 finger protein A2b)参与MYB30的泛素化修饰,是ABA信号通路的正调控因子,其过表达植株在种子萌发、幼苗生长和气孔响应等方面均对ABA超敏感并耐干旱胁迫;与过表达植株相反,其功能缺失突变体对ABA不敏感,并且不耐干旱胁迫[38]。RHA2b在细胞核中与MYB30相互作用,催化MYB30的第165位和第283位赖氨酸发生泛素化修饰,进而被26S蛋白酶体降解[39]。MIEL1(MYB30-interacting E3 ligase 1)E3连接酶也可调节MYB30泛素化,但是这一过程是参与病原菌侵染应答响应,而非ABA信号通路。MIEL1是通过调控MYB96转录因子的泛素化修饰来调控ABA信号转导通路的[40]。此外,其他调节MYB30泛素化降解的E3连接酶还有待揭示,因为在rha2b突变体中,MYB30蛋白的降解虽然延迟,但是仍然可以被降解。另外,其他的R2R3型转录因子如何被泛素化调控的还不清楚。

近年来,尽管研究者们已经鉴定出许多E3泛素连接酶调节ABA信号,但是有些E3的作用机制还有待揭示。比如拟南芥RING型E3泛素连接酶ATL61(ArabidopsisthalianaTóxicos en levadura 61)和大豆的U-box E3泛素连接酶GmPUB21(plant U-box 21)都参与ABA信号调节和干旱胁迫应答[29,41-42],但是底物仍然未知。

3 ABA信号转导中SUMO化修饰

SUMO是一类与泛素具有类似三维结构的多肽,大小约为11 kD,几乎存在于所有真核生物中[4]。SUMO蛋白的C末端均有结合底物所必需的甘氨酸-甘氨酸基序(Gly-Gly,GG),但是SUMO的Gly-Gly残基后有若干氨基酸序列延伸,需要在SUMO蛋白酶(SUMO protease)的作用下剪切后,暴露出Gly-Gly基序成为成熟的SUMO分子才能发挥作用[43]。SUMO化修饰过程与泛素化修饰相似,需要SUMO活化酶E1(SUMO-activating enzyme E1,SAE)、结合酶E2(SUMO-conjugating enzyme E2,SCE)和连接酶E3(SUMO-protein ligases E3,SPE)。首先,在SAE的作用下,SUMO成熟单体发生ATP依赖的激活,并将激活的SUMO转移到SCE上,最后在SPE的作用下,SUMO由SCE转移到底物上,完成SUMO化的过程[44-45]。

LOIS等[46]首次揭示SUMO化修饰与ABA信号通路之间关系。过量表达编码SUMO蛋白的SUMO1/2基因会提高植物体内蛋白质的SUMO化水平,一方面可以上调ABA应答基因的表达,一方面抑制植物对ABA的敏感程度。相反,当编码拟南芥SCE的AtSCE1a基因沉默时,植物体内蛋白质的SUMO化修饰水平降低,植株表现出对ABA超敏感的表型,即与野生型相比其生长被ABA高度抑制,叶片高度黄化[46]。然而该研究没有揭示SUMO化修饰调控ABA信号通路中的具体元件。

随着研究的深入,越来越多参与SUMO化修饰的酶被揭示参与ABA信号通路,并通过遗传和生化手段鉴定了SUMO化修饰的靶蛋白。除了上述提到的SCE,在参与SUMO化修饰过程的酶中研究最多的是SPE。拟南芥中已发现的SUMO连接酶E3有2个,即SIZ1(SAP and Miz 1)和MMS21(methanesulfonate sensitivity protein 21)/HPY2(high ploidy 2)。已有研究表明这2个E3连接酶都参与调控ABA信号通路,其中SIZ1的相关研究较为深入,但是MMS21的靶蛋白和作用机制还不清楚[37,47-48]。

此外,SUMO化是一个可逆的动态过程,SUMO可以被SUMO特异蛋白酶从被修饰的底物上切除。植物中的SUMO蛋白酶有ESD4(early short days 4)、TS1(overly tolerant to salt 1)、OTS2(overly tolerant to salt 1)和ASP1(ArabidopsisSUMO pro-tease1)等[49-50]。其中,ESD4和ASP1被报道参与调控ABA信号转导。但是相对于泛素化修饰来说,SUMO化修饰参与ABA信号通路调控的研究比较少,目前只有ABA信号转导通路中的转录因子和SnRK2蛋白激酶受SUMO化修饰调控。

3.1 ABA转录因子的SUMO化修饰

ABA信号通路中的bZIP转录因子ABI5可以被泛素化修饰并被蛋白酶体降解[27-31]。MIURA等[48]首次发现ABI5也可被SUMO化修饰,这个过程是由SUMO连接酶SIZ1参与催化的。拟南芥SIZ1基因的2个功能缺失突变体siz1-2和siz1-3都表现出对ABA超敏感的表型,并且一些ABA应答基因如RD29A、RD29B等的表达在siz1-1突变体中被明显上调。这表明SIZ1在ABA信号通路中起到负调控作用。遗传证据发现,ABI5功能缺失能够恢复siz1-2突变体对ABA超敏感的表型,暗示了SIZ1在ABI5的上游起作用。体外SUMO化试验发现,SIZ1可以使ABI5发生SUMO化修饰,并确定ABI5的SUMO化位点为第391位赖氨酸(K391)。在siz1突变体中ABI5蛋白的稳定性降低,表明SUMO修饰能够保护ABI5不易被蛋白酶体降解,即SUMO化修饰对ABI5的稳定性起正调控作用[48]。但是这一结果与siz1突变体对ABA超敏感的表型不一致,因此推测ABI5的SUMO化修饰水平可能影响其被磷酸化激活,即未被SUMO化修饰的ABI5蛋白会被磷酸化修饰激活。由此可见,各种翻译修饰协同调控ABI5蛋白的活性和稳定性的具体方式还有待深入研究。

转录因子MYB30除了可以被泛素化修饰调节,也同样可以被SUMO化修饰。ZHENG等[37]发现MYB30也是SIZ1的底物。MYB30的SUMO化位点位于第283位赖氨酸。ABA处理后siz1突变体中MYB30的蛋白水平降低。这表明SIZ1通过SUMO化修饰MYB30保护其不被降解,提高其稳定性[37]。GONG等[51]通过遗传学手段证明了K283位点对MYB30行使功能的重要性,并鉴定出MYB30的靶基因,并发现myb30-2突变体对盐胁迫敏感,盐胁迫能诱导SIZ1对MYB30进行SUMO化修饰。当把MYB30的SUMO化位点K283突变为精氨酸后,MYB30K283R无法恢复myb30-2突变体对盐胁迫敏感的表型。这表明SUMO化修饰对于MYB30参与ABA调控的盐胁迫响应至关重要。GONG等[51]通过转录组学分析鉴定得到编码交替氧化酶的AOX1a基因(alternativeoxidase1a)是MYB30的1个靶基因;在盐胁迫下MYB30直接结合AOX1a的启动子并上调其表达,而SUMO化位点发生突变的MYB30K283R无法结合AOX1a基因的启动子,这表明MYB30的SUMO化修饰对于其发挥转录调控功能是必须的。但是,盐胁迫诱导MYB30的SUMO化过程是否也受到ABA的调控还需要更多的证据来证明。总之,该发现提出了SIZ1-MYB30-AOX1a参与盐胁迫响应的调控模型,可为耐盐作物品种的创制和筛选提供途径。

SUMO化修饰是一个可逆的过程,这个过程由SUMO化酶催化完成。WANG等[50]发现,拟南芥SUMO化酶ASP1(ArabidopsisSUMO protease1)调控ABI5和MYB30的稳定性。生化证据发现,ABA可以诱导ABI5和MYB30蛋白的积累,但是和野生型相比,ABA处理后的asp1突变体中ABI5蛋白的积累降低,反而MYB30蛋白的积累升高,由此推测,ASP1正调控ABI5的稳定性,同时负调控MYB30的稳定性,最终正调控ABA信号通路。也就是说ASP1是ABA信号通路中的正调控因子。asp1突变体对ABA敏感程度降低也证明了这一结论。但是,ASP1作为去SUMO化的酶,却对ABI5和MYB30蛋白的积累有相反的影响。这表明ABI5是否为ASP1的直接底物还有待商榷,有可能ASP1通过影响参与ABI5泛素化修饰的酶的稳定性间接影响ABI5的稳定性,也有可能SUMO化修饰并非对蛋白质稳定性都起正向调控作用。

3.2 SnRK2s蛋白激酶的SUMO化修饰

SnRK2S是ABA信号转导中的重要蛋白激酶,SnRK2.6/OST1受HOS15泛素连接酶的泛素化降解[23]。CUI等[52]和CHANG等[53]发现,SUMO蛋白酶ESD4和其互作蛋白NUA(nuclear pore anchor)可通过去SUMO化SnRK2.6/OST1调控其稳定性,从而负调控ABA信号通路。拟南芥NUA基因是动物Tpr(translocatedpromoterregion)基因的同源基因[54],编码一类核孔锚定蛋白,是核孔复合体(nuclear pore complex,NPC)的一部分,与ESD4相互作用,调节ESD4的去SUMO化活性[55]。拟南芥nua和esd4突变体在种子的萌发及萌发后的生长方面都表现出对ABA超敏感的表型,并且更耐干旱胁迫和盐胁迫。SnRK2s功能缺失能恢复nua或esd4突变体对ABA超敏感的表型,表明SnRK2s可能位于NUA和ESD4的下游。生化证据表明,NUA和ESD4负调控SnRK2s蛋白的稳定性和激酶活性。体外SUMO化试验表明,SnRK2.6蛋白可以被SUMO化修饰,而ESD4会降低SnRK2.6的SUMO化水平,因此,NUA与ESD4可能是通过去SUMO化修饰降低蛋白质的稳定性[52-53]。结合SnRK2被泛素化修饰的研究,推测SUMO化修饰之所以提高蛋白质的稳定性,很有可能就是通过与泛素竞争结合蛋白质的赖氨酸残基,后续还需要通过鉴定SUMO化位点来验证。此外,与上述提到的ASP1相比,同样作为SUMO蛋白酶的ESD4却是ABA信号通路的负调节因子,由此可见其作用机制是不同的。abi5突变体也可以恢复nua突变体对ABA敏感的表型,那么NUA和ESD4是否直接调控ABI5去SUMO化修饰也是可探索的方向。此外,其他参与SUMO化修饰的基因也参与胁迫响应,但是是否通过ABA起作用,以及其中的作用机制还有待深入研究[56-59]。

4 泛素化和SUMO修饰共同调控ABA信号转导

SUMO分子和泛素分子具有高度相似的三维结构,并且C端均有结合底物必要的Gly-Gly基序,两者也都结合在靶蛋白的赖氨酸残基上。但是两者又有不同之处,比如两者一级结构相似性仅约18%,并且SUMO分子并不具有泛素分子形成多聚泛素化所需的48号赖氨酸残基,但是SUMO的Gly-Gly残基后有若干氨基酸序列延伸,需要剪切后才能成为成熟的SUMO分子[60]。由此看来,泛素化和SUMO化修饰虽有一定的相似之处,但又是完全不同的蛋白质修饰方式。

关于泛素化修饰和SUMO化修饰在信号转导通路中是如何相互协调作用的,在植物以外的其他物种中已有报道。一种可能是SUMO化修饰促进泛素化修饰,比如人FEN1(flap endonuclease1)蛋白被磷酸化修饰后,会发生SUMO化修饰,进而促进其被泛素化修饰,最后被蛋白酶体降解[61]。另一种可能是SUMO化和泛素化修饰之间是竞争关系,比如IκBα(inhibitor of nuclear factor-κB)被SUMO化修饰后,反而不易被泛素化修饰,也就提高了蛋白的稳定性[60]。

以ABA信号通路的转录因子MYB30的调控为例,讨论植物体内泛素化修饰和SUMO化修饰相互影响的过程。MYB30不但被RHA2b催化发生泛素化修饰,还可以在SIZ1的作用下被SUMO化修饰[37,39,51]。将MYB30-SUMO1(模拟SUMO化状态的MYB30)或MYB30转化拟南芥原生质体,当共表达RHA2b时,MYB30会发生降解,但是MYB30-SUMO1几乎不被降解。ABA处理后,siz1突变体中的MYB30稳定性降低,但是MYB30-SUMO1不受影响。这些结果均表明,SUMO化修饰的MYB30更稳定,不易被泛素化降解。另外,通过split-LUC试验发现,ABA处理前,SIZ1-MYB30的互作强于RHA2b-MYB30,但是ABA处理后,SIZ1-MYB30互作无明显变化,而RHA2b-MYB30相互作用增强,表明ABA促进MYB30的泛素化降解,而SIZ1能通过SUMO化MYB30保护其不被降解。此外,E3泛素连接酶RHA2b催化MYB30的K165和K283位点发生泛素化,其中K283也是SIZ1催化MYB30发生SUMO化修饰的位点[37,39]。这暗示了在MYB30的调控中,SUMO化修饰和泛素化修饰之间是拮抗的关系。ABI5[29,48,50]与SnRK2s[22-23,52-53]可以既被泛素化修饰也被SUMO化修饰,各种生化数据也暗示了2种翻译后修饰是竞争关系。

此外,参与去SUMO化修饰的SUMO蛋白酶ASP1和ESD4功能缺失后,MYB30和SnRK2s更加稳定[50,52-53],也暗示了SUMO化修饰对于蛋白质的稳定性是正向调节作用。但是,asp1突变体中ABI5的稳定性反而下降。这可能是ASP1通过调节某一未知的ABI5上游元件的SUMO化,间接影响ABI5的稳定性,也有可能SUMO化修饰并非对蛋白质稳定性都起到正向调控作用。因此,还需要更多的证据来证明2种蛋白质修饰之间的关系。

5 问题与展望

尽管已知许多ABA信号转导通路中的受体、PP2C磷酸酶、SnRK2激酶和一些转录因子都能够被泛素化修饰,但是到目前为止,被证实可以被SUMO化修饰的靶基因只有ABI5[37,51]、MYB30[50]和SnRK2.6[52-53]。其他ABA信号通路的元件在受到泛素化修饰调控的同时,是否也可被SUMO化修饰还需要证明,并且2种修饰之间是否存在竞争关系也需要探究。另外,磷酸化修饰也是普遍存在于ABA信号通路中的重要的翻译后修饰。有研究发现,磷酸化修饰促进ABA受体PYR/PYL的泛素化降解[62]。因此,ABA信号通路中的许多元件都有多种翻译后修饰调节,相互之间的协同作用也有待研究和探索。

此外,在拟南芥中许多参与泛素化或SUMO化修饰相关的酶或其靶蛋白表达异常,或者靶蛋白的修饰位点发生突变,都会改变植物对ABA和各种逆境胁迫的响应[42,57-59]。在作物中的同源蛋白同样也参与逆境胁迫。杨树(Populusalba)中U-box型E3泛素连接酶PalPUB79(plant U-box 79)通过调节ABA信号通路中的负转录因子PalWRKY77的泛素化降解,参与盐胁迫响应[63]。水稻(Oryzasativa‘Nipponbare’)SUMO蛋白酶OsOTS1(Overly tolerant to salt1)通过调控ABA和干旱胁迫应答转录因子OsbZIP23的去SUMO化修饰,负调控ABA信号通路[64]。辣椒(CapsicumannuumL. ‘Nockwang’)中SIZ1的同源蛋白CaDSIZ1通过调节转录因子CaDRHB1(干旱胁迫应答的正调节因子)的SUMO化修饰参与干旱胁迫应答[65]。由此看来,研究泛素化和SUMO化等修饰在ABA信号通路中的作用机制、挖掘农作物中的相关功能基因,以及筛选和鉴定抗逆农作物将具有重要的应用前景。