富血小板血浆与肌腱干细胞治疗跟腱病的研究进展

章 松 ,毛海蛟

（1.宁波大学附属第一医院,浙江 宁波 315010;2.宁波大学 医学部,浙江 宁波 315211）

自21 世纪以来,伴随全民运动的推广和普及,各类运动相关急慢性软组织损伤的发病率日渐增高,其中跟腱病是一种发生在运动人群中常见的肌腱损伤.基于普通人群和全科诊疗中患者的报告表明,1%～2%成年人(18～65 岁)在他们的一生中患有下肢肌腱病,而跟腱是最常发生的部位之一.据统计,运动员跟腱病终生患病率为23.9%,而普通人群为5.9%,跟腱病最常发生的年龄段为18～65岁,这个年龄段的肌腱病占所有年龄组病例的三分之二以上[1].

跟腱是小腿三头肌,即腓肠肌和比目鱼肌的肌腹下端移行的腱性结构,是人体最粗最大的肌腱之一,对于人体行走、站立和维持平衡有着重要的意义[2-3].同时跟腱也是最容易发生病理变化的肌腱之一.

跟腱病是慢性肌肉骨骼疾病,其发展及发生通常与肌腱负荷耐受性的降低或导致肌腱超负荷的运动有关,其他危险因素包括创伤、运动不足、类风湿性关节炎和类固醇药物等[4].病因上认为可能是慢性或重复的超负荷导致跟腱破裂或微撕裂,造成正常愈合过程失败,从而导致退行性跟腱病.跟腱病通常累及距跟骨附着点近端2～6 cm 的少血管区[5],在临床诊断中常出现的症状是跟腱及腱周组织肿胀、疼痛和跟腱功能受限.而跟腱损伤未经治疗或者病程超过4 周,则称为慢性跟腱病[3].

非手术治疗或者说保守治疗是大多数跟腱病患者的主要治疗方法[6],包括减少运动量、非甾体消炎药、穿软帮鞋或使用矫形鞋垫、硬化剂注射、体外冲击波治疗和偏心力量锻炼等[3,7].荷兰医学专家团队提出只有超过6 个月的保守治疗不能改善症状时才考虑手术[8],而对于跟腱病引起的跟腱断裂缺损多采用外科手术方式,包括一期延长修复、拇长屈肌腱移位术及游离肌腱移植重建等[3,9].

不幸的是由于肌腱的细胞和血管较少,其自愈能力相对低效,又因为肌腱并不能再生相同的肌腱组织,所以肌腱损伤修复是不完整的[7].肌腱修复还容易形成纤维血管瘢痕,导致再生组织较损伤前更弱.因此大多数跟腱病会发展成一种容易复发的慢性疾病,严重影响患者的工作和生活.在这种情况下,生物制品成为临床治疗中极具吸引力的解决方案.在过去十年里,使用生物制品和组织工程来促进跟腱修复和愈合越来越引起人们的兴趣[10].目前,不少实验和研究正在使用生物强化和组织工程技术,以促进跟腱的修复和愈合[11].

1 富血小板血浆治疗跟腱病

PRP 是利用血液制作而成的含高浓度血小板的血液制品,在应用中多为凝胶和液体两种形态.PRP作为一种含有生长因子的天然传导支架,被认为可以促进肌腱愈合[11].有研究表明,PRP 治疗跟腱病中的主要作用是促进胶原蛋白合成表达、刺激血管生成,增强跟腱干细胞增殖分化和细胞外基质的生成能力[12].其中,PRP 中的各种生长因子在刺激胶原沉积和肌腱再生方面起到了关键作用.PRP中包含多种内源性生长因子,如血小板源性生长因子(PDGF)、转化生长因子β(TGF-β)、血管内皮细胞生长因子(VEGF)、纤维生长因子(FGF)、内皮细胞生长因子(EGF)、肝细胞生长因子(HGF)、胰岛素样生长因子(IGF)等,可以促进肌腱细胞向跟腱损伤区域定向迁移和分化,能为细胞修复和损伤组织的再生提供血供和营养支持[11,13].

大量临床研究报道证实PRP 修复跟腱病的有效性和安全性.Padilla 等[13]更是将PRP 称之为跟腱修复中应用生物学和外科间的桥梁.Filardo 等[14]早在2010 年便已经展开了PRP 治疗跟腱病的前瞻性临床研究,研究纳入27 例患有慢性中段跟腱病(共34 条跟腱),且既往治疗无效的患者,每隔2 周接受一次超声引导下的肌腱内PRP 注射.经过治疗后患者的VISA-A(维多利亚学院足踝运动功能评估)评分有显著改善,从开始的基线评分为49.9±18.1，到治疗2 个月时增至62.9±19.8,6 个月时进一步改善至84.3±17.1,4 年半后评分稳定达到90.0±13.9.EQ-VAS 评分也呈现类似趋势,并且随着时间的推移,Tegner 评分也有显著改善.因此研究者认为对于慢性顽固性跟腱病的治疗,反复的自体PRP 腱内注射产生了良好效果,到中期随访时,临床症状持续稳定改善.而较长的症状持续时间和治疗前较低的功能水平正是患者较难恢复成完全正常活动与运动的原因.近年来,Boesen 等[15]、Abate 等[16]都对PRP 能否更有效地治疗跟腱病问题进行了临床研究,而研究结果都显示应用PRP治疗跟腱病在减轻疼痛、提高活动水平、降低肌腱厚度方面都有显著的效果.由此得出PRP在跟腱病的治疗中是一种安全且有吸引力的选择.

此外,不少学者对于PRP 是否有效治疗跟腱病做了大量的数据分析,结果也相当可观.Madhi等[5]为确定PRP 作为跟腱病治疗方案的疗效,检索2010 年1 月至2019 年2 月期间进行的所有关于PRP 治疗跟腱病的RCT、前瞻性和回顾性研究,将其中11 项符合标准的研究纳入,统计发现共230例患者在超声引导下局部注射PRP.该综述显示在PRP 使用后的患者总体VAST-A 评分都显著提高,此结论给予跟腱病的治疗带来了不错的前景.

目前为止,不少基础研究也证明了PRP在肌腱损伤愈合中的有益作用.巩栋等[17]采用PRP 治疗胶原酶诱导下的兔跟腱病模型,通过超声弹性定量成像检测技术评价跟腱相对硬度,电子拉力试验机测定跟腱最大断裂负荷,ELISA 法测定Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白含量,HE 染色和Masson 染色观察跟腱胶原纤维形态,最终得出PRP 治疗可增加跟腱硬度和最大断裂负荷,上调Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白表达水平,改善跟腱胶原纤维结构和形态,促进兔跟腱病的恢复.具体地说,PRP 中的生长因子显著促进了肌腱病的愈合.并且,欧洲肌肉骨骼放射学学会(ESSR)提出在超声引导下的PRP 注射治疗跟腱病是安全的,对跟腱病有显著的疼痛缓解作用,而且与皮质类固醇注射相比,在中长期随访中有更好的临床结果[18].

总之,PRP 的主要优点是安全,制备和给药方法简单,这也是PRP 得到广泛应用的原因.PRP 的安全性得益于它是从患者自身血液中提取的自体产品,含有血小板和生物活性因子,可以改善损伤部位的生物微环境,从而促进组织愈合[13].但是样本量不足和随机对照试验过少也是目前的研究短板.近来张栢毓等[19]的多中心随机试验纳入了跟腱中段疼痛超过3 个月的成年患者,分别接受安慰剂或自体PRP 注射跟腱,采用VISA-A 对患者的疼痛、功能和活动进行评分,结果在3 个月和6 个月的随访中,治疗组和安慰剂组之间的VISA-A 得分没有显著差异.另外有部分学者对于跟腱病的研究显示PRP 治疗跟腱疾病的效果也并未达到预期的目标[20-25].而证明其一贯有效性的最薄弱环节主要是各种PRP制备方法的不统一,以及它们的应用方式缺乏标准化[13].对于PRP 治疗跟腱病的研究未来应该要着重于合理规模的随机对照试验,以产生更一致的结果.

2 肌腱干细胞治疗跟腱病

近来对于TSCs 的热门研究也为肌腱疾病乃至跟腱病的治疗提供了一个可行的研究方向.TSCs是肌腱组织经消化后提取的具有自我更新及多向分化能力的细胞,早在2007 年,Bi 等[26]已从成人、小鼠中提取并鉴定了TSCs.TSCs 的发现给肌腱病发病机制带来了新认知,TSCs 的非成腱分化如成脂肪分化、成软骨分化和成骨分化等都会导致肌腱病的发生及发展[27-28].抑制TSCs 错误分化,调节TSCs 向肌腱细胞的分化可能是未来研究的重要领域,并可能为肌腱病提供新的临床治疗方法[27].Chen 等[29]通过微阵列筛查发现Fos基因是肌腱早期分化中的有效转录因子,并通过细胞片层和三维细胞培养模型证实Fos基因的表达变化与肌腱表型的丢失和恢复有关,此外,Fos在TSCs 中的过表达诱导了肌腱标志物的基因表达上调.该研究证实Fos基因是介导TSCs 向成熟肌腱细胞分化的有效分化因子,为TSCs 逐步分化为成熟肌腱细胞奠定了基础,同时也为肌腱再生奠定了相关基础.

TSCs 的发现和研究的深入为肌腱病治疗提供了全新思路.肌腱的自我修复能力有限,通过干细胞补充来更新损伤肌腱组织的细胞治疗方法备受追捧,其中与肌腱同源的TSCs 更是最佳选择[30].Durgam 等[31]在使用胶原酶诱导建立的马肌腱病模型上注射TSCs 进行治疗,12 周后进行基质基因表达、生化、生物力学和组织学特征的评估,研究结果显示TSCs 组胶原排列明显优于对照组,从而得出TSCs 可以改善修复组织的抗张强度和胶原纤维的排列.Komatsu 等[32]成功研制了TSCs 片剂,并将其运用于大鼠跟腱缺损模型中,在植入TSCs 片材后2 周和4 周,大鼠跟腱的组织学特性和胶原含量均显著改善,提示TSCs 片材可以有效地促进跟腱愈合和重塑,该研究成果展现了组织工程技术在肌腱病治疗上的良好前景.Chen 等[33]通过构建一种基于三维单轴拉伸系统用于刺激TSCs 分化为肌腱组织,最终组织学分析证实了方法的有效性.近来,Zhao 等[34]发现长链非编码RNA MALAT1 在转化生长因子β1(TGF β1)处理的TSCs 中表达上调.而生物信息学分析显示miR-378a-3p 是MALAT1和MAPK1 的靶点,双荧光素酶实验表明MALAT1和MAPK1 均可与miR-378a-3p 结合.随即他们选取18只SD 大鼠建立肌腱病模型,通过实验发现敲除下调miR-378a 3p 可逆转MALAT1 的作用,而MAPK1 的过表达可以逆转miR-378a-3p 模拟物的作用.最后得出MALAT1 在肌腱病变大鼠中表达下调,MALAT1 过表达可治愈肌腱损伤的结果,说明MALAT1 通过调控miR-378a-3p/MAPK1 轴调控TDSCs成腱分化,表明靶向MALAT1/miR-378a-3p/MAPK1 轴可能是治疗肌腱病变的一个有前景途径,也为应用TSCs 治疗跟腱病打开了一扇大门.

TSCs 与骨髓间充质干细胞相较于其他多种干细胞具有多项优势,如增殖快、肌腱修复特异性强、再生时间短、成肌腱性优越等[26].TSCs 与骨髓间充质干细胞相比较,干细胞标记物(如OCT-4)、腱细胞标记物(如腱调节蛋白、核心蛋白聚糖和I型胶原)、软骨形成标记物(II 型胶原和双聚糖)和成骨标记物(碱性磷酸酶)的表达水平都较高[35].并且相比骨髓间充质干细胞,肌腱中干细胞的百分比至少比骨髓抽吸物中的百分比高出3 个数量级.更重要的是,TSCs 在培养过程中表现出更强增殖能力,与骨髓间充质干细胞相比,只需要更短时间就能达到治疗目的的数量[36].然而自体肌腱中TSCs 数量也不多,仅占1%～4%[26],所以从自体获取大量TSCs 较为困难.而且,TSCs 也具有多向分化的潜能,这意味着它不仅可分化为肌腱细胞,还能在一定条件下转变成为脂肪细胞、软骨细胞、骨细胞[37].因此如何为TSCs 增殖制定最佳的分离、扩增、长期培养并定向分化为肌腱细胞的方案就成了TSCs运用于治疗跟腱病的研究热点.

目前流行的TSCs 直接注射到损伤肌腱内进行细胞治疗的方式可能会导致细胞死亡,降低治疗效果.近来,Li 等[38]证明EUG-BMSC-EV(经丁香酚处理后的骨髓间充质干细胞来源的细胞外小泡)可以通过激活Nrf2/HO-1 通路来保护TSCs 免受氧化应激的损伤,这意味着经EUG-BMSC-EV 处理的TSCs 移植有可能成为加强TSCs 治疗效果的可行方法.Mao 等[39]将TSCs 种植在脱细胞后的猪小肠粘膜下层(SIS),用于治疗跟腱缺损,治疗效果较单独使用SIS 更佳.此外也有学者使用生物相容性载体来搭载干细胞治疗肌腱相关疾病,如使用PRP负载TSCs 并刺激其增殖和分化来治疗跟腱病.

3 TSCs 与PRP 联合治疗跟腱病

大量研究表明,PRP 具有促进TSCs 增殖和迁移、诱导TSCs 分化为腱细胞能力.多项研究发现PRP在体外对TSCs的增殖具有良好激活作用[40-41].PRP 可提供肌腱修复所需的多种生长因子(血小板源性生长因子、转化生长因子-β、血管内皮生长因子等),显著促进TSCs 的增殖迁移,肌腱细胞相关基因和蛋白的表达,以及总胶原蛋白的产生,从而促进TSCs 分化为活性干细胞[42].其中,PRP 以活化FAK 和ERK1/2 信号通路方式促进TSCs 的成腱性分化,Chen 等[43]研究中发现PRP 可诱导TSCs 的FAK 和ERK1/2 信号通路活化,且对这两条通路中任意一条进行抑制后,TSCs 成腱性标志物Ⅰ型胶原蛋白(COL1A1)、Scleraxis 转录基因(SCX)、腱糖蛋白-C(Tenascin-C)表达减少.Jo 等[44]在体外研究中发现PRP 促进了退行性撕裂的人肩袖肌腱细胞的细胞增殖、肌腱代表性糖蛋白及肌腱特异性标志物基因表达和肌腱基质的合成.近年来,Tarafder等[45]对FAK 或ERK1/2 激动剂的小分子进行筛选之后发现Oxo-M(Oxotremorine M)和4-PPBP(PPBP maleate)具有极高地诱导TSCs 成肌腱分化潜能的能力.在跟腱病治疗中,PRP 还可以通过提供血小板和纤维蛋白基质中丰富的生长因子来增强和促进跟腱愈合,而纤维蛋白基质作为一种天然有利于组织愈合的支架同样发挥作用.PRP 中的肝细胞生长因子(HGF)在促进TSCs 增殖和分泌过程中起着重要作用,Zhang 等[46]通过对条件培养液(CM)的蛋白组学分析确定HGF 是蛋白相互作用网络的枢纽,随后用HGF诱导的TSCs+CM来治疗跟腱损伤,发现HGF可以刺激TSCs 分泌可溶性产物,从而提高肌腱成纤维细胞存活率和迁移能力,改变细胞外基质(ECM)蛋白的表达,促进肌腱纤维的机化,抑制炎症反应,改善跟腱损伤的生物力学性能.

Chen 等[43]通过胶原酶注射建立大鼠跟腱病模型后,分别应用生理盐水、TSCs、PRP、PRP+TSCs处理4 周或8 周后,通过组织学和生物力学测试评价肌腱质量,并通过蛋白组学分析FAK/ ERK1/2信号通路和腱细胞相关基因.最终发现与其他组别相比,TSCs 联合PRP 治疗组的跟腱组织学结果改善最为明显,腱细胞相关基因的表达也最为活跃.从而推断PRP可以诱导肌腱细胞相关基因的激活,并通过ERK1/2 信号通路促进TSCs 向腱细胞分化.Xu 等[42]对大鼠跟腱断裂模型的研究也表明PRP 可有效激活TSCs 向肌腱细胞的分化,TSCs 联合PRP治疗后加速了跟腱损伤后的愈合过程.咸杰等[47]通过注射前列腺素E2 诱导TSCs 成骨和成指分化,从而构建了新西兰兔的跟腱病模型,分别用PRP、TSCs、PRP+TSCs、生理盐水治疗,运用组织学染色及金属蛋白酶1 检测对治疗效果进行了评估,结果表明富血小板血浆与肌腱干细胞共混物可通过抑制肌腱细胞外基质及胶原降解的恶性循环、下调肌腱细胞中金属蛋白酶1 表达,延缓肌腱病炎性反应及退行性改变.近来,Fedato 等[48]将跟腱病的细胞治疗与离心训练进行比较,对大鼠跟腱病模型进行了研究,发现TSCs 联合PRP 治疗跟腱病相较离心训练有更好的生物力学结果.

组织工程中的生物材料作为支架可用于提供机械支持或作为可递送生长因子的载体,目的是为细胞的附着、增殖和随后的迁移提供合适环境,从而为细胞外基质重塑和最终的天然组织再生提供基础[49].随着生物材料的不断发展,将PRP与不同材料复合的研究逐渐增加,通过复合材料改变PRP 性状,达到PRP 中多种生长因子的缓释,也可以将复合材料植入或缝合在患处,更加地贴合临床.PRP 与水凝胶、软骨再生支架、丝素胶原蛋白等复合形成的支架材料[50-51]均有潜力成为TSCs 的生物载体,用于治疗跟腱病.另外对于PRP 的类型还有待选择优化,Zhang 等[52]研究表明酶激活受体(PAR)1 或par4 激活PRP(PAR1-PRP,PAR4-PRP)对TSCs 和肌腱愈合的作用存在差异.目前国内对于PRP的临床应用还处于不成熟阶段,应用治疗中还主要以经验性为主.不过伴随着PRP提取制备技术的日益成熟和PRP 相关基础研究的深入,PRP 联合TSCs 的疗法将在跟腱乃至肌腱疾病的治疗中发挥重要作用.

4 结论与展望

临床上以保守治疗为主的跟腱病治疗效果与理想疗效差距较大,修复损伤跟腱并恢复其正常结构和功能可以看作是基础和临床研究中的一个难题.而PRP 与TSCs 的发现和发展为该临床常见疾病治疗策略的研究提供了新方向.跟腱相关的再生医学和组织工程通过联合支架材料、种子细胞、生长因子形成组织工程肌腱以促进跟腱再生,这方面工作是目前研究的热点.组织工程中的生物材料作为支架可提供机械支持,或作为可递送生长因子载体,目的是为细胞的附着、增殖和随后的迁移提供合适环境,从而为细胞外基质重塑和最终的天然组织再生提供基础.我们也正在对跟腱病的治疗进行相关研究,将PRP 与TSCs 结合作为复合生物材料支架植入损伤跟腱,促进细胞外基质重塑和跟腱组织再生,实现跟腱病的治愈.而理想的生物材料应模拟天然跟腱细胞外基质的结构和生物力学性质,同时有效地反映跟腱组织愈合的时空信号特征,还能充当基因、蛋白质和细胞的缓释递送原型,为细胞渗透到损伤部位提供合适环境.现阶段对于PRP 在细胞因子缓释方面、模拟天然细胞外基质结构以及模拟跟腱组织生物力学性质的研究上仍有所欠缺,需要进一步探索和研究.以PRP 为基础模拟天然的细胞外基质结构促进TSCs 增殖定向成腱分化,同时模拟跟腱组织的生物力学性质,还需将PRP 中的生长因子精确缓释递送至跟腱损伤部位,这些都是在研究中亟待解决的关键问题,也是未来研究的主要方向.相信随着TSCs 的深入研究、PRP 制备技术的完善和相关组织工程的大力发展,未来实现跟腱病治愈前景光明.