一种全自动药敏系统检测念珠菌抗真菌药物敏感性的应用评价

田瑞卿 王琦琦 万喆 李若瑜 刘伟

(1.北京大学第一医院皮肤性病科,北京大学真菌和真菌病研究中心,北京 100034;2. 保定市第一医院检验科,保定 071000)

近年来,随着肿瘤放化疗、器官移植、介入操作、糖皮质激素及广谱抗菌药物的广泛应用,侵袭性真菌病的发病率和死亡率逐年升高。在侵袭性真菌感染中侵袭性念珠菌病最常见,且病死率最高[1]。多项研究显示念珠菌对抗真菌药物的耐药发生率呈逐年上升趋势,念珠菌的耐药问题受到人们越来越多的关注[2-3]。因此,对病原真菌进行体外抗真菌药物敏感试验也显得尤为重要。目前,真菌药敏试验方法以手工法或半自动的方法为主,随着真菌检出率的不断提高,临床实验室急需引入全自动的真菌药敏试验方法以提高工作效率。

本研究以CLSI M27-A4微量肉汤稀释法为参考方法,探讨一种全自动真菌药敏分析系统对念珠菌属体外药物敏感性的检测能力。

1 材料与方法

1.1 菌株来源

全部受试菌株分离自临床各类标本,保藏于北京大学真菌和真菌病研究中心,包括白念珠菌40株、近平滑念珠菌20株(含2株似平滑念珠菌)、光滑念珠菌18株、热带念珠菌18株、克柔念珠菌2株、葡萄牙念珠菌1株、季也蒙念珠菌1株;质控菌株为近平滑念珠菌ATCC22019和克柔念珠菌ATCC6258。所有菌株经显色培养基传代培养进行初步鉴定,纯培养物使用布鲁克质谱仪进行准确鉴定,可信度低者或显色表型与质谱鉴定不一致的菌株采用ITS区序列分析准确定种。所有菌株从-70 ℃保藏冰箱取出后,在35 ℃下沙堡弱琼脂斜面培养基上连续传代2次,以保证受试菌株的纯度和活力。

1.2 仪器和试剂

全自动药敏系统,包括全自动药敏仪、真菌药敏盘、培养液等由复星诊断科技(上海)有限公司提供;U型96孔药敏板购自江苏世泰实验器材有限公司;沙堡弱培养基购自江门市凯林贸易有限公司;RPMI-1640粉为美国Gibco公司产品;两性霉素B购自华北制药股份有限公司,其他抗真菌药物购自华中海威(北京)基因科技有限公司。

1.3 微量肉汤稀释法

肉汤培养基和梯度浓度药敏板的制备以及菌悬液的制备和接种均按照美国临床实验室标准化协会(CLSI)M27-A4进行[4]。接种后的药敏板于35 ℃培养箱中孵育约24 h,两性霉素B读取生长完全(100%)抑制的最小抑菌浓度(MIC),其他药物读取相对于阳性对照孔50%抑制的药物浓度。每个受试菌株进行两次重复检测,读取MIC结果时由2～3人共同完成。

1.4 全自动真菌药敏

按照复星诊断真菌药敏试剂盒的操作说明进行操作,约24 h后仪器自动读取MIC值并判读结果。

1.5 质量控制

每次试验用上述两种方法平行测试质控菌株ATCC22019和ATCC6258,所测结果均应在规定的MIC范围内。

1.6 数据分析

基本一致性(essential agreement,EA),试验方法与参考方法的MIC结果相差在两个倍比稀释度之内的样本比率[5];分类一致性(categorical agreement,CA),试验方法与参考方法敏感性一致的样本比率[6],以2020版CLSI文件M59 3rd edition和M60 2nd edition折点和流行病学界值(epidemiological cutoff value, ECV)作为CA分类的判断标准[7-8]。极严重错误(very major error, VME)：试验方法检测结果为敏感,参考方法为耐药;严重错误(major error, ME)：试验方法检测结果为耐药,参考方法为敏感;一般错误(MiE)：试验方法检测结果为中介,参考方法为耐药或敏感;或者参考方法的检测结果为中介,试验方法为耐药或敏感。

2 结 果

2.1 全自动真菌药敏与CLSI M27-A4检测念珠菌属对抗真菌药物的敏感性结果

表1列出了两种方法测定白念珠菌、近平滑念珠菌、光滑念珠菌和热带念珠菌对9种抗真菌药物的MIC范围,以及50%和90%菌株生长受抑制时的MIC值(分别表示为MIC50和MIC90)。总的来说,全自动方法测得的MIC与CLSI方法相比,相同或偏高。在检测白念珠菌对两性霉素B,近平滑念珠菌对阿尼芬净,光滑念珠菌和热带念珠菌时对泊沙康唑时,全自动方法测定的MIC略低于微量肉汤稀释法。

2.2 全自动真菌药敏与CLSI M27-A4检测念珠菌抗真菌药物敏感性的一致性评估

如表2所示,对于40株白念珠菌而言,其中10株白念珠菌,全自动方法测得的MIC高于CLSI两个稀释度以上,白念珠菌的卡泊芬净基本一致性为75%,但根据折点判断后,分类一致性为100%。其他药物的基本一致性和分类一致性均在85.5%以上。

表1 两种方法测定9种抗真菌药物对念珠菌的最小抑菌浓度(MIC)

(续表)

对于18株光滑念珠菌,其中7株卡泊芬净的MIC为0.06～0.25 μg/mL,根据折点判读后,分类一致性为61.1%,但基本一致性为100%。伏立康唑也存在类似问题,基本一致性为100%,根据ECV判断后,分类一致性为66.7%。其他药物的一致性在94%以上。

在18株热带念珠菌中,其中2株耐药的热带念珠菌,伊曲康唑和伏立康唑两个药物,全自动方法测得MIC>8 μg/mL,超出CLSI 测定结果两个梯度以上,根据折点判读,两种方法伏立康唑均为耐药,而伊曲康唑根据ECV全自动方法判定为非野生型(NWT),CLSI方法判定为野生型(WT)。泊沙康唑的分类一致性为83.3%,其他药物一致性在94%以上。

两种方法测定100株念珠菌对9种抗真菌药物总的基本一致性在89%以上,总的分类一致性在91%以上。

2.3 试验方法与参考方法检测结果误差分析

对有临床折点的药物进行误差分析发现,相对于参考方法,全自动方法测定结果未出现严重错误(ME)和极严重错误(VME),均为一般错误(MiE),其中氟康唑、伏立康唑和阿尼芬净均出现了4个一般错误,米卡芬净1个一般错误,卡泊芬净8个一般错误,在检测光滑念珠菌时,卡泊芬净的敏感性结果有7个一般错误,见表3。

3 讨 论

在侵袭性念珠菌病的病原菌中,已发现超过15种念珠菌可导致人类感染,白念珠菌、近平滑念珠菌、热带念珠菌和光滑念珠菌是我国侵袭性念珠菌感染的主要病原菌[9]。本研究选取了上述常见的临床分离株以及其他少数不常见念珠菌为研究对象,具有临床指导意义。

随着抗真菌药物的广泛应用,念珠菌的耐药问题也逐渐受人关注。光滑和热带念珠菌对唑类药物的耐药性在国内外均有报道[10-12]。准确、规范的念珠菌体外药物敏感性检测方法对耐药菌株的检出和临床抗真菌药物的选择具有重要的指导价值。参考方法微量肉汤稀释法为手工操作、复杂、耗时,不宜在常规实验室开展。目前国内获注册证的商品化检测试剂品种有限,实验室应用较多的有ATB FUNGUS 3,Sensititre YeastOne显色药敏板,多以手工操作为主[13-15]。本研究以微量肉汤稀释法CLSI M27-A4为参考,评价一种全自动药敏分析系统的应用价值,旨在将这种全自动真菌药敏检测技术普遍应用于临床。

表2 两种方法检测念珠菌抗真菌药物敏感性的一致性

表3 试验方法检测念珠菌体外药物敏感性误差分析(个)

使用质控菌株ATCC22019和ATCC6258进行质量控制,在质控菌株结果均在控的情况下,将两种方法检测的念珠菌对9种抗真菌药物的MIC 进行比较,基本一致性在89%以上,分类一致性在91%以上,对于有临床折点的药物进行误差分析显示,全自动方法测定结果只出现了少数一般错误(MiE),而无严重错误(ME)和极严重错误(VME)。按照不同菌种的抗真菌药物敏感性比较,对于白念珠菌而言,卡泊芬净的基本一致性偏低,为75%,这些菌株见于药敏试验存在明显的拖尾情况,全自动方法的MIC读取结果高于参考方法两个稀释度以上,这表明该系统可能对于存在拖尾的药敏结果判读不准确。但根据折点判断后,两种方法判读的结果均为敏感,分类一致性为100%。在18株光滑念珠菌中,两种方法结果的基本一致性为100%,但其中7株光滑念珠菌卡泊芬净的MIC范围虽然为0.06～0.25 μg/mL,但根据折点判读后,分类一致性较低,为61.1%,因为差一个药物浓度梯度就是不同的判断结果,导致光滑念珠菌对卡泊芬净的敏感性结果中有7个一般错误。检测光滑念珠菌对伏立康唑的敏感性时,存在类似现象,两种方法测定的MIC基本一致性为100%,但根据ECV判定后,6株光滑念珠菌复星的检测结果为NWT,而参考方法为WT。根据CLSI M59和M60,念珠菌属没有氟胞嘧啶的判断标准,白念珠菌没有伊曲康唑的判断标准,但两种方法所测定MIC均在两个稀释梯度之内,基本一致性均为100%。此外,克柔念珠菌、葡萄牙念珠菌、季也蒙念珠菌检测菌株数较少,两种方法测定的MIC 均在两个稀释度之内,然而克柔念珠菌的卡泊芬净和泊沙康唑两个药物,根据ECV判读后,各有1株菌敏感性结果不一致,其他药物判读结果均一致。

针对上述问题,认为这与本研究选取不同种念珠菌的数量较少有关,这也是本研究的不足之处,还有待于加大各种常见念珠菌的菌株数量,并且能更多地覆盖其他少见念珠菌,从而为全自动真菌药敏分析系统的应用提供更有力的依据。然而需要指出的是,真菌药敏试验采用“90-60规则”,这意味着由敏感菌株引起的感染中,90%的概率治疗有效,而由耐药菌株引起的感染60%病例也可能治疗成功。因此,除了考虑两种方法的一致性之外,应进一步结合体内疗效分析,以便药敏试验能够更加客观地反映抗真菌治疗的临床疗效[16-17]。

综上所述,全自动真菌药敏分析系统检测念珠菌属体外药物的敏感性与CLSI参考方法相比,具有很好的一致性,且操作简便,能够自动判读结果,有利于同时检测多个样本,在临床微生物实验室具有很好的应用价值。