不同产区白芷遗传多样性和品质特征

王丽赟，孙 健，陈梦莹，姚 辉，周水灯，王海阁，王 盼，徐凯玠，王志安,

（1.浙江省中药研究所有限公司，浙江 杭州 310023；2.浙江中医药大学 药学院，浙江 杭州 310053；3.浙江农林大学 浙江省特色中药资源保护与创新利用重点实验室，浙江 杭州 311300；4.磐安县中药创新发展研究院，浙江 磐安 322399）

白芷药材为伞形科Apiaceae植物白芷Angelica dahurica或杭白芷A.dahuricavar.formosana的干燥根，具有解表散寒、祛风止痛、宣通鼻窍、燥湿止带、消肿排脓的功效[1]。白芷含有香豆素类、挥发油类、苷类、生物碱类、多糖类、氨基酸类等多种化学成分[2]，香豆素是白芷中含量较多的一大类活性成分。已有研究表明[3−5]：水合氧化前胡素、白当归素、佛手柑内酯、氧化前胡素、欧前胡素、异欧前胡素、花椒毒酚等主要标志性成分可以反映白芷药材的质量差异。在遗传方面，刘倩倩等[6]和侯凯等[7]分别应用分子标记对不同白芷资源遗传组成开展研究，结果显示SSR和ISSR标记均可以应用于白芷资源的遗传组成研究。然而已有研究的取样范围较窄，大多未包括传统的北方白芷产区。同时，白芷资源存在产地变迁和引种栽培行为，但近10 a对白芷的研究集中在品质成分、栽培技术和药理等方面，而有关白芷遗传的研究却较少。相关序列扩增多态性(SRAP)是基于PCR技术的经典标记系统[8]，多应用于药用植物群体遗传组成分析[9−10]。

遗传组成和产地环境的差异均有可能引起白芷药材品质和化学组成变异，已有研究多是通过采集不同产地材料分析不同产区的白芷药材品质差异[4, 11]，没有系统地分析不同白芷主产区样品的遗传组成及其与品质变异的相关性。本研究收集中国白芷主产区种源，栽培于同一个资源圃内，应用SRAP分子标记对收集的白芷样品进行遗传组成分析，从遗传背景上对不同种源进行区分，同时，通过测定7种香豆素化学成分对白芷进行品质评价，探究不同产地间白芷遗传组成与品质差异的相关性，为白芷药材开发及新品种选育提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

2019年10月，在四川、浙江、安徽、河北、河南等白芷主产区省份收集25份白芷资源(表1)，栽培于杭州市原种场。2020年9月，在叶片枯萎时对同圃种植的25份白芷资源进行采收，取白芷根部，55 ℃烘干后打粉，编号后置于4 ℃冰箱密封保存。

表1 供试白芷种源信息Table 1 Information of tested materials of A.dahurica

1.2 仪器和试剂

实验仪器主要包括Agilent 1260高效液相色谱仪(Agilent公司，美国)、色谱柱(Agilent Eclipse XDBC18 4.6 mm×250 mm)、Veriti 96 Well Thermal Cycler型 PCR 仪 (Thermo Fisher Scientific 公司，美国)、Power PacTM-Basic/HV 型电泳仪、GelDocTM XR +型凝胶成像仪 (美国 Bio-Rad 公司)。欧前胡素 (批号：HS19326S1)、异欧前胡素(批号：HS9499S1)、白当归素(批号：HR19108W3)、氧化前胡素(批号：HR71244W5)、佛手柑内酯(批号：HR1141W8)、水合氧化前胡素(批号：HS91011B1)对照品均购自于宝鸡市辰光生物科技有限公司；花椒毒酚对照品(批号：nkl211109006)购自于成都钠钶锂生物科技有限公司；甲醇(批号：20210322)、乙醇(批号：20200710)为分析纯，购自于上海凌峰化学试剂有限公司；流动相甲醇为色谱纯(批号：U9OG1H)，水为重蒸馏去离子水。三羟基甲基氨基甲烷(批号：T57320)、核酸染料YeaRed、2×HieffTM PCR Master Mix等均购自于上海翊圣生物科技有限公司；SRAP引物委托上海生工生物公司合成，置4 ℃冰箱保存。所有试剂均为分析纯。

1.3 醇溶性浸出物含量检测

取供试样品粉末2 g，置于100 mL锥形瓶中，加入50 mL水，密塞，称质量，静置1 h后，连接回流冷凝管，加热至沸腾，并保持微沸1 h。放冷后，取下锥形瓶，密塞，再称质量，用水补足减失的质量，摇匀，用干燥滤器滤过，量取滤液10 mL，置于已干燥至恒量的蒸发皿中，在水浴锅上蒸干，于105 ℃干燥3 h，置干燥器中冷却30 min，迅速称质量。以供试样品的干燥品计算供试样品中的醇溶性浸出物质量分数(%)，每个供试样品重复3次。

1.4 香豆素类化合物检测

1.4.1 色谱条件 色谱柱为 Agilent Eclipse XDB-C18 (4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相为甲醇 (B)-水(A)，梯度洗脱百分值为体积分数，洗脱程序为：0～25 min，40%～45%B；25～45 min，45%～60%B；45～50 min，60%～80%B；50～60 min，80%B；60～70 min，80%～90%B；70～75 min，90%～40%B；75～80 min，40%B；流速为 1.0 mL·min−1；柱温为 25 ℃；进样量为 10 μL；检测波长设定为 300 nm。

1.4.2 对照样品溶液的制备 称取水合氧化前胡素、白当归素、佛手柑内酯、氧化前胡素、欧前胡素、异欧前胡素、花椒毒酚适量，加甲醇溶解，转移至10 mL容量瓶，将其配置成1 mL分别含有0.728、0.659、0.699、0.639、0.721、0.747、0.639 mg标准品的单一对照样品溶液；吸取上述储备液适量，混合后加甲醇稀释，使最终制成质量浓度分别为12.760、4.482、5.768、35.649、37.856、14.498、6.390mg·L−1的混合对照样品溶液。

1.4.3 供试样品溶液的制备 取供试样品粉末 (过 3 号筛) 1.0 g，置于 50 mL 量瓶中，加 45 mL 甲醇，超声处理(功率300 W，频率50 kHz) 1 h，取出，放冷，加甲醇至50 mL量瓶刻度，摇匀，滤过，取续滤液过0.45 μm的微孔滤膜，即得供试样品溶液。

1.5 PCR 扩增及电泳检测

每份样品随机剪取新鲜幼嫩的叶片，采用CTAB法[12]提取白芷DNA，基因组DNA用1×TE缓冲液将样品DNA浓度调至100 mg·L−1，并置于4 ℃冰箱保存。筛选出扩增结果稳定，重复性好的8对SRAP 引物。PCR 扩增反应体系为 10 μL：模板 DNA(100 mg·L−1)1 μL，5′端引物 (10 μmol·L−1) 0.8 μL，3′端引物 (10 μmol·L−1) 0.8 μL，Mix-Taq 6 μL，滴加 ddH2O 至 10 μL。参考岑晓霞等[13]的方法进行扩增后，置于4 ℃冰箱保存。PCR扩增结束后，进行凝胶电泳，获取条带信息。

1.6 数据分析方法

利用NTSYSpc 2.10e软件对样本进行聚类分析并绘制树状图。通过SPSS 23.0软件对数据进行整理分析，采用单因素方差分析法(one-way ANOVA)检验差异显著性；通过Origin软件，采用主成分分析法(PCA)[14]以降维方式提取主成分；通过中药指纹图谱相似度评价系统2004软件建立对照指纹图谱，计算样品的指纹图谱相似度。

2 结果与分析

2.1 遗传组成分析

2.1.1 SRAP 扩增产物多态性分析 筛选的 8 对 SRAP 引物共扩增 82 条条带，其中多态性条带有41条，多态性百分率为27.27%～80.00%，平均为50.00%，多态性最好的引物组合为Me4+Em8 (表2)。

表2 不同 SRAP 引物扩增结果Table 2 Statistical amplification results of different SRAP primers

2.1.2 基于分子标记的聚类分析 利用分子标记扩增的条带信息，以非加权组平均法(UPGMA)对25份白芷种源进行聚类。从图1可见：所有样本分为2个大类群，在遗传相似系数为0.84处，5个河北产区样本聚为一类。在遗传相似系数为0.87处，湖南、江苏、山东3个产区的样本单独聚为一类；四川、重庆、浙江和部分河北种源共同聚为一类。总体而言，浙江、四川和部分河北产区的样本基本各自聚为一类。本研究在河北和安徽产区采集的样本散布在浙江或四川产区的分类中，推测可能存在白芷种质资源引种行为。

图1 基于分子标记信息的不同白芷资源UPGMA聚类图Figure 1 UPGMA dendrogram of different A.dahurica resources based on molecular marker

2.2 品质特征分析

2.2.1 高效液相色谱法 (HPLC)检测体系构建 取混合对照样品溶液 2、4、6、8、10、12、14、16、20 μL注入液相色谱仪，记录峰面积，以峰面积(y)为纵坐标，以进样量(x, μg)为横坐标，进行线性回归，得到水合氧化前胡素、白当归素、佛手柑内酯、氧化前胡素、欧前胡素、异欧前胡素、花椒毒酚的线性回归方程(表3)，判定系数R2均大于0.999，证明各化合物在线性范围内线性关系良好。对本研究建立的HPLC检测体系进行方法学考察，结果显示该方法合理可行。

表3 白芷药材 7 种香豆素类化合物成分的线性关系Table 3 Linear relationships of 7 coumarin compounds in A.dahurica

2.2.2 香豆素和浸出物成分定量分析 取25份同圃种植的白芷药材，应用HPLC法定量7种香豆素类成分。从表4可见：25份白芷种质资源的7种香豆素成分质量分数从高到低依次为欧前胡素、氧化前胡素、异欧前胡素、佛手柑内酯、水合氧化前胡素、白当归素、花椒毒酚，均值分别为2.428、1.404、0.806、0.317、0.181、0.057、0.007 mg·g−1。国家药典委员会规定白芷药材的欧前胡素质量分数不得少于0.080%[15]，本研究中，资源圃25份白芷样品欧前胡素质量分数仅样品HBD-1未达国家药典委员会的标准，而样品AH-S、ZJ-F、ZJ-M欧前胡素质量分数表现突出，高于4 mg·g−1。对25份白芷药材的7种香豆素类化合物成分进行PCA分析(图2A)，结果显示：第1主成分(PC1)解释了53.5%的方差，第2主成分(PC2)解释了23.7%的方差，2个主成分可解释原变量的77.2%的信息，可见，种源与成分组成没有明确规律。应用共有峰峰面积，对25份白芷样品进行PCA分析(图2B)，结果显示：浙江种源的白芷材料与其他种源出现了一定的分离。

图2 基于 HPLC 的不同白芷药材成分 PCA 分析Figure 2 PCA analysis of A.dahurica based on HPLC

表4 不同种源白芷的香豆素类成分和醇溶性浸出物特征Table 4 Contents of coumarin components and ethanol-soluble extractives in A.dahurica

2.2.3 基于 HPLC 特征峰值的品质变异度分析 通过HPLC特征峰的指纹图谱数据分析，25份样品的色谱图如图3A所示，其中标定共有峰17个，如图3B所示。其中样品ZJ-L在27 min时有较强的吸收峰，其余样品在此处的吸收峰较小。另外，不同样品共有峰峰面积差异较大。

图3 不同白芷药材的 HPLC 指纹图谱Figure 3 HPLC fingerprints of A.dahurica

3 讨论

SRAP分子标记方便快速，不需要预先知道DNA顺序信息，结果稳定可靠，再现性高，重复性好，适合用于遗传多样性和亲缘关系等方面的研究[16]。对比其他药用植物群体的遗传组成研究结果，本研究表明：栽培白芷具有较好的遗传多样性，这可能与其有性繁殖的形式有关[17]，不同产区白芷种源的遗传组成相近，种源间遗传分化较弱，这与侯凯等[7]的分析结果一致。与此同时，部分来自河北和安徽地区的白芷种源与南方杭白芷聚为一组，无明显区分，却与北方本地种源遗传差异较大，该聚类结果可能与不同产区白芷资源的种差异有关，而同为杭白芷种的四川种源与浙江种源分别聚集，可能与引种后的地理隔离有关[18]。与白芷类似，同为伞型科植物的前胡Peucedanum praeruptorum，同样因为人为引种导致栽培种的遗传分化变小[19]。李嘉惠等[20]基于SRAP分子标记构建何首乌Fallopia multiflora核心种质库，结果表明野生何首乌的遗传多样性比栽培居群的大，栽培居群间分化程度极高，但基因交流极小，说明栽培行为对遗传分化影响较大。

已有研究仅应用10份样本检测表明：不同产区间白芷药材的品质差异显著[4]，也有研究对各产地白芷药材香豆素类成分分析表明：河南、河北与四川、安徽的白芷药材根据香豆素类成分差异被分为两类[20]，而本研究增大了研究样本后发现：不同种源同圃栽培后品质没有明显的种源区别，这说明不同产区的环境因子可能是影响不同产区白芷品质差异的主要因素。同时，浙江传统产区的种源品质特征与其他主产区呈现出一定的差异性，即遗传分化体现在品质特征分化上，该结果可能是浙江的老产区多为个别农户留种小面积栽培，不与其他产区进行品种交流而导致的。