外泌体靶向递送核酸类分子研究进展

贾 岳 李 妍 王英骥

1.哈尔滨医科大学药学院无机化学教研室，黑龙江哈尔滨 150081；2.黑龙江中医药大学附属第一医院中医转化医学研究中心，黑龙江哈尔滨 150040

1983 年，外泌体在绵羊网织红细胞中被首次发现，1987 年，Rose 将其命名为exosomes，外泌体是包含小分子核糖核酸（microRNA，miRNA）和蛋白质的小细胞外囊泡[1]。目前基于脂质体[2]、聚合物[3]和纳米颗粒[4]用于药物递送的治疗性纳米颗粒在改善药物的溶解性、化学和生物功能的稳定性和效能取得了一些进展，但这些纳米载体仍存在靶向能力差、纳米载体及其降解产物存在细胞毒性等问题。近年来，聚焦于开发内源性细胞或亚细胞结构载体，特别是细胞来源的外泌体成为研究热点。外泌体作为生物标志物，在药物输送，尤其是外泌体靶向递送核酸类分子表现出巨大的潜力。本文对利用外泌体以囊泡形式作为新型药物递送载体核酸类药物的递送进行综述，旨在为临床靶向治疗提供新思路。

1 外泌体起源及特征

外泌体起源于内体小泡[5-6]。当腔内囊泡形成的多囊泡体与其他囊泡相交时，外泌体的成分也会发生变化，直到多囊泡体融合到质膜上并将外泌体释放到细胞外环境中[6]，这项特质为药物递送载体提供了新的方向。通常外泌体由细胞核酸、脂质、蛋白质和代谢产物组成[7]。外泌体的起源受到亲代细胞的生理和病理状况制约，甚至释放位点也最终决定了外泌体的组成。依据囊泡特定的蛋白质标记和来源对细胞外囊泡进行分类，包括外泌体、微粒/微囊泡、凋亡小体3 类[8]。外泌体内含脱氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid，DNA）、复杂RNA 和特异蛋白质等，可以在细胞间转移传递核酸、生物活性脂质和蛋白质等物质[9]。细胞来源不同时，外泌体所含的成分也不同，但蛋白类多含有膜转运蛋白和融合蛋白（GTPases、annexins 和flotillin）、肌动蛋白以及与代谢相关的酶类等[10]；脂质多为鞘磷脂[11]、磷脂酰胆碱[12]、甘油类[13]等；核酸类成分多为miRNA、mRNA、DNA 等。

外泌体介导细胞间通讯，免疫反应，心血管疾病，神经元疾病和肿瘤发展，从而有效地改变生物反应[14]。外泌体可以装载治疗性药物并靶向运输到特异细胞，已经包括miRNA、小干扰核糖核酸（small interfering RNA，siRNA）、抗miRNA、中药活性提取物、阿霉素、抗体和其他药物活性物质等，在治疗多种类型的肿瘤中取得重要进展[15]。作为崭露头角的药物载体，外泌体与其他相比具有自己的独特优点，纳米尺度，具有较好的生物兼容性使其具有成本效益，且易于进入细胞。血液半衰期长且稳定性高，可确保它们在宿主的生理和病理状态下均能长距离传播。外泌体穿过血脑屏障的能力比其他纳米技术更好，用于治疗中枢神经系统相关疾病[16]。此外，外泌体的亲水核心使它们能够使水溶性药物的装载能力更强[17]。良好的生物相容性，药物循环时间更长，组织以及持续释放能力更强，也是外泌体成为各种药物输送系统中具有优势的载体[18]。

2 外泌体靶向递送核酸类分子

2.1 miRNA

miRNA 是一类具有18～27 个核苷酸的单链RNA，它可以结合目标mRNA 并抑制其翻译。miRNA 影响肿瘤的增殖和发展，并控制其与目标基因相关的信号通路，以实现肿瘤抑制或致肿瘤功能[19]。Jeong 等[20]选择HEK293T 衍生的外泌体通过转染装载miRNA-497，观察到非小细胞肺癌细胞（A549 细胞）在有效剂量下成功摄取了miRNA-497 外泌体，抑制了A549 细胞中血管内皮生长因子-A、Yes 相关蛋白1、肝癌衍生生长因子和细胞周期蛋白E1 基因的表达，并且抑制与A549 细胞共培养的人脐静脉内皮细胞的血管生成。表明miRNA-497 具有协同抑制肿瘤生长和血管生成的作用，因此外泌体介导的miRNA 治疗方法与微流控技术相结合，可能成为开发靶向癌症治疗的一种预测、成本效益高的转化工具。除胚胎细胞外，来自脂肪组织的干细胞（adipose-tissue derived mesenchymal stem cell，AMSC）也是一种有希望的微囊泡资源。miRNA-122 转染的AMSC 能有效地将miRNA-122包裹到外泌体中，介导miRNA-122 在AMSC 与肝癌细胞之间的通讯，使肿瘤细胞对化疗药物敏感[21]。随后该小组用外源性miRNA-199a 修饰了相同的外泌体，发现这些工程化的外泌体直接靶向mTOR，从而切断了肿瘤化学抗性的一条途径，使肝癌细胞对体内阿霉素的治疗敏感[22]。这两种给药方式提供了增强肝癌细胞化学敏感性的新策略。外泌体除了可以通过提高药理作用来治疗肝癌外，在肝纤维化或肝硬化的情况下，可以考虑从影响细胞外环境的角度解决问题。Wang等[23]确定miRNA-335 在EV-miRNA-335-5p 治疗后下调的信使RNA 靶点，为肝癌的潜在治疗策略提供了证据。人肝样细胞来源的外泌体可减少从消化组织中分离的肿瘤来源内皮细胞的血管生成，Lopatina 等[24]在人肝脏干细胞胞外囊泡中鉴定出4 种miRNA，即miRNA-15a、miRNA-181b、miRNA-320c 和miRNA-874，这4 种miRNA 可以有效地抑制体内和体外的血管生成，这可能是通过抑制成纤维细胞生长因子1 和尿激酶型纤溶酶原激活剂等预测靶基因的表达来实现。人肝样细胞来源的外泌体的抗血管生成作用在肿瘤来源的内皮细胞上很明显，但尚无法证明外泌体是靶向肿瘤的，如果将这些特定的miRNA 亚型作为靶向治疗的有效药物，那么外泌体的靶向性将保证其生物安全性。外泌体将特定的miRNA 递送到肿瘤细胞中的广泛应用，在很大程度上推动了药物靶向运输系统的发展。

对于miRNA 结合靶mRNA 的能力可以促进或抑制基因表达。miRNA-21 是最早发现的miRNA之一，胶质母细胞瘤是中枢神经系统致命性肿瘤，其miRNA-21 水平明显升高[25]。胶质母细胞瘤相关巨噬细胞分泌大量oncomiRNA-21，同时对替莫唑胺具有高度的化学抗性，并通过阻碍程序性细胞死亡基因4、Fas 死亡结构域相关蛋白、转化生长因子受体等发挥抗凋亡作用[26]。表明胶质母细胞瘤中miRNA-21 表达下调是可以实现的，通过与miRNA-21 抑制剂和替莫唑胺联合治疗，其凋亡率明显高于单独的替莫唑胺治疗[27]，但由于替莫唑胺易产生耐药和miRNA-21 抑制剂给药困难等原因，可通过外泌体给药系统中寻求更好的给药途径。miRNA-21 在胃癌也高度表达，同样外泌体对miRNA-21 抑制剂的类似治疗也获得了良好的效果，且细胞毒性小[28]。使用miRNA-21 抑制剂转染后，PDCD4 基因及其BGC-823 细胞蛋白的表达增加[29]。miRNA-9 是在替莫唑胺产生耐药性后胶质母细胞瘤细胞中表达的另一种miRNA，其功能是参与药物代谢转运蛋白的合成。在此基础上，抗miRNA-9-Cy5 被MSCs 分泌的外泌体转运以阻断miRNA-9，从而成功保留了胶质母细胞瘤细胞中的多种药物转运蛋白和化学抗性。同种异体间质干细胞显示出与自体外泌体几乎相同的作用，提示这可能是一种潜在治疗方案[30]。

外泌体miRNA 不仅用于肿瘤治疗，还用于治疗缓解肺纤维化，采用月经血干细胞的外泌体miRNA Let-7减轻了博来霉素诱导的肺纤维化和通过造成活性氧，mtDNA 受损和NLRP3 炎症小体敏化，阻止了小鼠的肺泡上皮细胞凋亡[31]。在肺纤维化中，通过抑制WNT基因所产生的人支气管上皮细胞所衍生的外泌体miRNA 可抑制转化生长因子，使小鼠模型的肺纤维化程度有效衰减伴随β-连环蛋白和细胞衰老标志物的表达降低，表明通过miRNA 介导的TGF-β-WNT串扰抑制，人支气管上皮细胞外泌体给药是治疗肺纤维化的潜力的治疗方案[32]。外泌体作为新型的介导细胞间信号传导的物质，外泌体miRNA 通过影响免疫相关基因的表达，在肿瘤的生长、血管生成、侵袭和转移中起调节作用，同时外泌体miRNA 还可以调节肿瘤细胞的化学耐药性。

2.2 siRNA

外泌体在体外最初被证明是受体细胞的外源siRNA 的天然载体，其中针对RAD51 的siRNA 抑制RAD51 能力较强并导致生殖细胞大量死亡[33]。上皮间质转化在头颈癌的转移、侵袭和多药耐药性过程中起着至关重要的作用，外泌体包裹的TRPP2 siRNA 抑制了目标肿瘤细胞的上皮间质转化表达。在核酸酶和血清存在的情况下，复合物的高稳定性证明外泌体是体内携带治愈性siRNA 的潜在工具，外泌体/TRPP2 siRNA 复合物能否进行靶向递送仍需要进一步确认[34]。白细胞-3 受体在慢性粒细胞白血病细胞中比正常造血干细胞高表达并刺激疾病发展，推测白细胞-3 受体可能是药物递送系统的治疗靶标[35]。白细胞-3-Lamp2b 质粒将DNA 转染到HEK293T 细胞中，收集与白细胞-3 融合的Lamp2b 蛋白高表达外泌体，工程化改造后的外泌体将被装载BCR-ABL siRNA 递送到对伊马替尼耐药的慢性粒细胞白血病细胞用以治疗，表明靶向细胞在体外和体内均克服了药理耐药性问题。对于其他类型的血液病，如急性髓细胞性白血病也有望使用这种新的药物递送系统进行治疗[36]。脑内皮细胞和脑肿瘤细胞的外泌体已被证实是穿透血脑屏障的有效工具。脑内皮bEND.3 细胞源性外泌体比单独siRNA 更有效地穿过斑马鱼的血脑屏障，囊泡中包裹的血管内皮生长因子siRNA 极大降低了胶质母细胞瘤-星形细胞瘤U-87 MG 细胞的荧光强度[37]。U-87MG 细胞分泌的外泌体携带有疏水基团的hsiRNA治疗带有siRNA 的亨廷顿舞蹈病。装载hsiRNA 的外泌体被小鼠原代皮层神经元同化，以剂量依赖的方式抑制亨廷顿蛋白及其相应蛋白[38]，提示脑细胞衍生的纳米级外泌体是抗脑肿瘤药物的潜在载体。外泌体具有较高的生物相容性，使其显示出重要的临床价值，为药物递送开辟了新的思路，但由于缺乏临床数据，现在还无法完全预测外泌体载siRNA 的安全性及有效性，还需要优化外泌体的生产和分离方法，以期获得大小适宜、分布均匀的外泌体群；使外泌体有潜力成为siRNA 和基因治疗的新型载体。

2.3 DNA

Thakur 等[39]和Yang 等[40]证明了外泌体中存在的DNA。将DNA 直接转移到外泌体外，将带有甲胎蛋白基因（rAAV/AFP）的腺体相关病毒载体预装载到树突状细胞中，可以收集重组外泌体并刺激未成熟T 细胞以及细胞毒性T 淋巴细胞的数量迅速增加，从而激活了对肝细胞癌的抗癌免疫反应。重组外泌体对超敏反应的树突状细胞前体更有效地激发组织相容性复合体限制的细胞毒性T 细胞反应，使树突状细胞充分利用次要抗原肽[41]，提示了具有DNA 的外泌体可作为癌症的辅助治疗。由于间充质干细胞衍生的外泌体激发几种类型的肿瘤细胞亲本细胞使其具有非常强的归巢能力，提示它们具有基因治疗的潜力。水平基因转移是外泌体药物递送系统生物安全的主要考虑因素。由于O-RBC 不含DNA，使其外泌体具有携带基因的巨大潜力。通过这些外泌体携带治愈性RNA，即Cas9 mRNA 和与细胞相关的指导RNA，可以在增强CRISPRCas9 基因组的同时具有较小的细胞毒性[42]。

3 展望

外泌体有望在临床上提供具有成本效益且更准确的肿瘤靶向治疗。尽管天然或合成的外泌体药物取得了令人鼓舞的结果，但一些未知因素，例如外泌体携带药物聚集，导致释放效率可能被高估。以及在不完全了解肿瘤中各种分子之间的相互作用情况下，研究中的某些积极结果也有可能是外泌体的潜在副作用。因此，亟须建立全面的评估体系，以期发现更多潜在功能以及药物递送风险性，同时优化和改善药物输送系统的生物相容性，生物分布和装载药物的方法，仍然是当前面对的重大挑战。