中国水仙离体快繁技术研究进展

刘晓红,冯雅妹

(太原学院 艺术设计系,山西 太原 030032)

中国水仙(Narcissustazettavar.chinensis)是石蒜科水仙属的一种多年生草本植物。作为欧洲水仙(N.tazetta)的一个变种,中国水仙在唐朝初期由地中海引进到中国,因其耐寒性差,主要分布于东南沿海温度湿润地区,北方地区主要用于室内水养观赏[1]。中国水仙花姿雅致,花色淡雅,芳香,是早春重要的园林花卉,可用于片植、花坛、花境等,还可作切花以及盆栽。

由于是同源三倍体植物,中国水仙很难通过杂交的方式来获得后代,所以自然条件下多用分球繁殖。但这种繁殖方式不仅繁殖系数低,周期长,而且病毒积累也较为严重。离体快繁不仅可以进行脱毒苗的培养,而且短时间内可以得到大量的优良植株,因此离体快繁技术对于中国水仙的繁育有着重要意义。

植物组织培养技术始于19世纪末,20世纪后期迅速发展成熟[2]。20世纪70年代初首例水仙花(Narcissustazettacv. Grand Soleil d’Or)离体植株再生获得成功[3]。虽然中国水仙在我国已有近千年的栽培历史[4],但对它离体培养开始得并不早,始于20世纪80年代。福建省由于得天独厚的水仙资源条件在中国水仙组织培养方面的研究位于全国前列。1980年丁雪英等[5]以漳州水仙鳞片、茎锥、嫩叶等为外植体,由愈伤组织获得鳞茎和绿株,并继续分生得到了带根的水仙鳞茎。陈振光[6]用中国水仙鳞茎外植体通过一年切块繁殖,可获得以万计的小鳞茎,大大提高了水仙的繁殖系数。在之后的40多年间,中国水仙的离体快繁技术取得了一些进展。

1 低温预处理

低温预处理可以提高中国水仙组织培养的成活率和诱导率。完全没有经过低温预处理的漳州水仙鳞茎组织切块会发黄发褐,成活率很低。经过4～10 ℃低温预处理4～9周后,诱导率会大幅提高[7]。低温预处理可以保持外植体原有的颜色和活力,减少褐化,提高诱导能力[8-9]。冷处理后的鳞茎盘分化时间缩短,分化能力明显增强[10]。杨柳燕等[11]发现冷处理9周水仙鳞茎诱导率为100%。郑春明[8]将2～3 a生鳞茎球存放在4 ℃左右的冷藏箱中,发现低温处理3周可明显提高外植体的成活率、生长速度和诱导率。

2 消毒剂的研究

2.1 升汞处理

庄晓英[10]对8种不同升汞浓度和热水处理时间组合研究表明:用0.1%的升汞处理20 min,55～60 ℃的无菌热水处理2 min,0.1%的升汞处理5 min,中国水仙外植体污染率最低、增殖系数最高。蔡月琴等[12]发现0.1%升汞处理组灭菌效果比2%次氯酸钠处理组好。水仙鳞茎用0.1%的升汞处理12 min内层鳞片的污染率最低,存活率最高,达到73.3%。刘炤[13]对不同的消毒灭菌方式进行比较发现采用多步混合消毒方式可以有效降低中国水仙鳞茎污染率。

2.2 次氯酸钠处理

对中国水仙花苞来说,相对于0.1%的升汞,灭菌温和的2%的次氯酸钠浸泡处理20 min效果最好[12]。对水仙花苞和主球进行消毒处理,25%次氯酸钠处理20 min污染率达100%,用30%次氯酸钠消毒侧球30 min污染率则降到39.1%[14]。25%次氯酸钠浸泡“云香水仙”鳞茎30 min的消毒效果最佳,在次氯酸钠浓度相同的情况下,消毒时间越长,污染率越低[15]。

综上可知,消毒剂的使用除自身浓度和处理时间外,必要时还需要与其他方式,如热水处理等相配合,才能达到最佳的消毒效果。

3 外植体部位及大小

3.1 外植体部位的选择

3.1.1鳞茎和鳞片

中国水仙离体培养最常用的外植体是带鳞茎盘的双鳞片、双鳞片或鳞片[16]。不带鳞茎盘的鳞片培养诱导率较低,鳞茎最内层鳞片培养效果较好[7-8]。章萍萍等[17]则认为漳州水仙鳞茎诱导中层最好,外层则容易产生褐化。双鳞繁殖被认为是水仙组织快繁的有效方法[18]。

庄晓英[10]发现鳞茎盘、鳞茎、试管小鳞茎叶都可以分化出愈伤组织,其中鳞茎盘是最佳的外植体,分化率可达100%。熊莉君等[19]也发现带鳞茎盘的中国水仙鳞茎外植体的脱分化和再分化能力都很强。因此认为,在选择外植体的过程中,选择形态学下端的外植体较好。

3.1.2花葶

栾爱业[20]选择3种不同生长阶段的花葶,发现生长一段时间后,花苞还没有抽出鳞茎时的花葶诱导率最高,幼嫩的花葶外植体容易褐变,但当材料逐渐成熟时褐变会消失。王文婷[14]用花葶直接诱导不定芽,发现花葶虽然可以成功地诱导出不定芽,但是诱导出来的芽普遍较小,绿叶的抽出也相对困难,并且诱导苗后期培养中非常容易死亡。

3.1.3子房

将中国水仙子房外植体做成切片培养,可以产生大量的不定芽[6]。子房的愈伤组织的诱导率较高,质量也好。由子房诱导出来的愈伤组织分化培养,也表现良好[14]。崔瑞峰等[21]却发现子房外植体对诱导愈伤组织能力比鳞茎、花梗和叶片差。蔡月琴等[12]发现消毒后子房接种后可迅速脱分化,但进行继代培养时就变得很困难,最终会褐化并死亡。漳州水仙子房在不同时间取材,愈伤组织的诱导结果也不同。幼嫩子房的诱导率并不高,诱导程度会随着子房成熟度提高[20]。

3.2 外植体的大小

外植体切法与大小影响小鳞茎的质量和增殖率。何玮毅等[22]发现8 mm×5 mm左右的中国水仙带鳞片的鳞茎盘在增殖率和小鳞茎的质量等方面优于4 mm×3 mm的外植体。但是外植体的体积越小,经过流水处理后的外植体的污染率越低[8]。

3.3 外植体的年龄及月份

陈振光等[23]对中国水仙外植体的年龄及月份的研究发现1 a生的中国水仙鳞茎分化和诱导小鳞茎能力都很强。对于不同月份来说,九月份外植体诱导率最高。庄晓英[10]对1～3 a生的经过冷处理鳞茎的鳞茎盘和鳞茎叶做了对比研究却认为从分化率和增殖率来看,2 a生的鳞茎盘最佳。

综上所述,中国水仙适合的外植体部位有鳞茎盘、双鳞片、花葶、子房、花药[24-25],花序轴[26]等,但带鳞片的鳞茎盘是最常用和分化效果最好的外植体。对于鳞茎的年龄来说,选择1 a生中国水仙最好,冷处理的鳞茎盘则选择2 a生的最好;接种时间选择九月份最佳。流水冲洗的时间相同,外植体的越小,污染率越低。

4 培养基

4.1 基本培养基

早期进行中国水仙外植体培养时,学者们大多数都选择MS培养基作为基本培养基,因为这个培养基养分数量和比例合适且适用范围广。如李招文等[7]对中国水仙在MS和N6两种培养基培养的对比试验表明MS培养基培养的水仙鳞茎成球率和诱导率都比在N6培养基里的高。栾爱业[20]选用MS,N6和MS(1/2NH4NO3)3种培养基诱导中国水仙的子房和花葶的愈伤组织,其中MS培养基诱导率最高。陆春芳等[9]对相同激素的MS培养基和N6培养基进行对比,认为MS培养基是崇明水仙组培的最佳培养基。陈振光等[23]发现中华培养基是诱导小鳞茎最佳的培养基,诱导率在初代培养中高达54.5%,在增殖继代培养中高达108.3%;其次是N6培养基;Morel培养基效果最差。

4.2 激素配比的研究

在组培过程中激素对于外植体的生长有重要作用,激素可以提高外植体的初代培养、增殖培养、生根培养的速度,缩短外植体培养的时间,提高效率,因此激素的选择对中国水仙工厂化发展具有重要意义。

中国水仙愈伤组织的诱导大多使用的激素是萘乙酸(NAA),2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)和6-苄氨基嘌呤(6-BA)。崔瑞峰等[21]认为只采用2,4-D进行培养效果就很好。而丁雪英等[5]认为培养基中加入NAA 3 mg/L,2,4-D 1 mg/L诱导愈伤组织的效果好。杨柳燕[11]、王文婷[14]、熊莉君[19]、杨会苗[27]、顾亨森[28]、方琪等[29]则发现6-BA和2,4-D的组合效果最佳。对于6-BA+NAA的组合,无论什么浓度下的培养基都无法诱导出来愈伤组织,它只对分裂有用,对于分化来说用处不大[29]。还有研究发现3种激素组合使用效果也好[30]。

不同激素浓度组合还会影响诱导小鳞茎的效果。如李招文等[7]在利用水仙鳞茎进行初代培养时,培养基中加入2 mg/L的NAA对小珠球的形成效果较好;附加6-BA,成球率略有下降。刘炤[13]采用鳞茎作为外植体发现激素组合为NAA 1 mg/L+6-BA 5 mg/L时分化小鳞茎效果最好,杨柳燕[31]也发现NAA和6-BA组合的效果最佳。继代培养中小鳞茎的发生与生长素有着密切关系,有学者认为只用NAA继代培养效果最好[7]。而有些学者则认为几种生长素组合的培养效果较好。如丁雪英等[6]发现诱导培养的最佳激素配比为2,4-D∶NAA=1 mg/L∶3 mg/L,并在培养基中添加10%的椰汁效果最好。另外也有研究发现生长素组合中加入6-BA的分化效果最好[13-14]。

NAA和6-BA对不定芽的诱导起到主要作用,如金雄霞等[32]对中国水仙鳞茎盘外植体和愈伤组织进行诱导,发现NAA 1.0 mg/L+6-BA 10 mg/L最好。林加根等[33]认为漳州水仙鳞茎诱导芽的最佳培养基是MS+6-BA 5.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L。王文婷[14]对花葶的诱导试验,发现最佳培养基激素组合为6-BA 5 mg/L+NAA 0.2 mg/L。

生根培养中研究最多的是NAA的浓度,如顾亨森等[28]用中国水仙的不定芽和中国水仙小鳞茎为外植体,发现NAA的浓度在0.01～0.30 mg/L时不定芽都可以生根;对于小鳞茎来说NAA浓度0.03 mg/L最合适。刘炤[13]对比发现只添加NAA的培养基生根效果比只添加IBA的好,最佳的生根培养基为1/2MS+NAA 0.5 mg/L。而蔡月琴等[12]的生根培养过程中却发现1/2MS+ IBA 1 mg/L的培养效果最好,证明IBA对生根诱导也有很好的促进作用。另外NAA和IBA组合使用对生根也有良好的效果[32-33]。

4.3 糖类及附加物

糖类可以为组织培养提供碳源,陈振光等[23]对不同种糖类试验表明砂糖的诱导效果好于蔗糖。杨柳燕等[26]发现提高蔗糖浓度,有利于试管球的增殖和膨大,蔗糖浓度在40 g/L时试管球的增殖率最大,可达157.5%。活性炭显著降低试管球的增殖率,但对生根则有着促进作用。而郑春明[8]发现硝酸银的浓度在2.5 mg/L时水仙的诱导率高达91%,适量的硝酸银对不定芽的形成有促进作用,愈伤组织再分化时不定芽不但生长速度较快,而且芽健壮整齐。但过量的硝酸银则起到抑制作用,其生理生化机理不明。熊莉君等[19]将MS培养基中KH2PO4浓度加倍时小鳞茎增长速度较快,证明了P、K肥可以促使小鳞茎增大。

5 培养环境

光质和光照时间都会影响中国水仙的培养效果,水仙愈伤组织诱导黄光效果最好,红光最差。绿光进行愈伤组织分化时的分化率最高[34]。MS培养基中KH2PO4浓度加倍与黑暗组合处理时,对水仙小鳞茎径围增大有显著影响[19]。

6 炼苗和移栽

炼苗和移栽是植物离体快繁过程的最后一步,它关系着组培苗成活率的高低。郑春明[8]对组培苗在4种不同处理介质中的移栽成活率进行研究,发现成活率都高于75%。杨柳燕等[11]将水仙组培苗室温炼苗后直接栽入大田,可见水仙组培苗的适应能力比较强。

7 中国水仙离体快繁脱毒技术的应用

中国水仙离体快繁技术不仅可以大量快速地将具有优良性状的植株繁育,在其他方面也有着重要作用。如在水仙脱毒方面有重要意义,利用DHT和高温处理会降低病毒率;利用DHT和病毒唑各30 mg/L可有效降低NMAV病毒(水仙斑驳相关病毒),且不影响试管球存活;利用DHT和病毒唑各10 mg/L可将NDV(水仙退化病毒)和NCLV病毒(水仙普通潜隐)完全去除[31]。

8 存在问题与前景展望

与其他植物一样,中国水仙的组织培养中也面临着污染、褐化和玻璃化三大难题,此外病毒积累也是一个严重问题,因此利用微茎尖培养等技术生产中国水仙脱毒苗是非常必要的。

由于组织培养生产成本较高,有学者用液体培养基[32]进行水仙外植体震荡培养,不添加凝胶成分也可以获得较佳的成果。因此探讨如何在保证培养效果的前提下降低生产成本,也是今后中国水仙组织培养的一个研究方向。

目前中国水仙组织培养相关的研究报道数量不多,可运用于生产的成熟的组织培养快繁体系尚未建立。未来需要更加重视水仙的组织培养相关研究,以推动水仙生物技术相关领域的技术突破。