低氧环境下菊苣酸对SD大鼠心肌组织低氧适应性的影响

刘嘉华，吴 华，行倩文，刘 波，张龙飞，王梦杰，陈鑫磊，王文胜

(青海大学 农牧学院，青海 西宁 810016)

高海拔地区自然环境特殊，空气中氧气含量随着海拔高度的升高而降低，一般认为海拔3 000 m以上的地区为低氧环境。当机体受到低氧刺激时，体内氧化与抗氧化系统失衡，氧化中间产物如活性氧(ROS)等大量产生，导致脂质过氧化、线粒体功能损伤、细胞凋亡等，进而威胁机体生命活动健康[1-2]。心脏是对缺氧反应敏感的器官之一，增强心脏的功能及低氧适应能力，可为高海拔低氧地区动物机体生命活动的维持提供更有利的保障。因此，开发有效的增强动物心肌低氧适应能力的饲料添加剂显得极为重要。

菊苣酸(chicoric acid,CA)又称二咖啡酰酒石酸，是一种咖啡酸类衍生物，主要存在于紫锥菊等植物中，是一种天然的免疫活性成分。众多研究表明，CA具有增强免疫、抗炎、抗病毒、抗氧化等作用[3-4]。SCHLERNITZAUER等[5]研究证明，CA是一种有效的ROS清除剂，可通过减少氧化应激条件下的ROS积累，发挥抗氧化损伤作用。蔡坤玲等[6]研究表明，CA可促进超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)活性，起到抗氧化作用。WU等[7]研究表明，低氧环境下CA可促进牦牛心肌组织HIF-1α、EPO、VEGF等低氧适应基因的表达，增强高寒地区牦牛的低氧适应性。本课题组前期研究表明，低氧环境下CA可通过作用于SD大鼠血液学指标，增强SD大鼠对高海拔低氧环境的适应能力[8]。然而，目前关于CA对低氧环境下SD大鼠心肌组织低氧适应性的研究鲜见报道。基于此，本试验拟以SD大鼠为研究对象，于低氧环境下对SD大鼠灌胃不同浓度CA，明确CA对SD大鼠心肌组织低氧适应性的影响。拟为解析CA对SD大鼠心肌组织低氧适应潜在的影响作用及缓解高海拔地区动物低氧应激提供新思路。

1 材料与方法

1.1 实验动物及材料60只6～8周龄、体质量为(192.00±7.35) g的健康雄性SD大鼠(P<0.05)，购自青海喜马拉雅动物实验中心有限公司(动物许可证号：SCXK(陕)2018-001)，于青海省河南蒙古族自治县畜牧兽医工作站(海拔3 500 m，氧浓度13.65%[9])进行饲养。紫锥菊提取物——CA购自西安锐博生物科技有限公司。成分：CA含量4%，其中CA(2.0%～2.2%)+咖啡酸(1.0%～1.5%)+绿原酸(0.5%～1.0%)+紫锥菊甙(0.3%～0.5%)，为黄绿色精细粉末。

1.2 主要试剂SD大鼠饲料、试验用杨木刨花垫料均购自江苏省协同医药生物工程有限责任公司；0.9%氯化钠注射液购自石家庄四药有限公司；4%多聚甲醛购自Biosharp生物公司；水合氯醛购自上海展云化工有限公司；ROS测定试剂盒、丙二醛(MDA)测定试剂盒、SOD测定试剂盒、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)测定试剂盒、CAT测定试剂盒、超微量Na+K+-ATP酶测试盒、超微量Ca2+-ATP酶测试盒、总蛋白(TP)测定试剂盒均购自南京建成生物工程研究所；线粒体呼吸链复合体Ⅰ、Ⅲ活性检测试剂盒购自索莱宝科技有限公司；HIF-1α、VEGF、EPO引物购自生工生物工程(上海)股份有限公司；TRNzol Universal总RNA提取试剂盒、cDNA反转录试剂盒、SuperReal彩色荧光定量预混试剂盒均购自天根生化科技有限公司；HIF-1α、VEGF、EPO抗体、辣根过氧化酶(HRP)标记山羊抗兔IgG、牛血清白蛋白(BSA)、苏木素染液、DAB显色剂均购自赛维尔生物科技有限公司。

1.3 低氧环境下SD大鼠饲养试验将60只SD大鼠于室温(21±2 )℃(试验时间：2021.06.06-2021.08.08)进行饲养。适应性喂养2周后将SD大鼠随机分为对照组、不同剂量CA组(10，20，40 mg/kg)，每组15只。每天上午9:00对SD大鼠进行灌胃，对照组SD大鼠灌胃0.5 mL生理盐水，试验组SD大鼠分别灌胃10，20，40 mg/kg剂量的CA，并每天称体质量，4组SD大鼠饲喂基础饲粮条件一致，连续灌胃49 d后进行试验。基础饲粮组成：谷物类原材料占比80%，包含玉米、次粉、小麦、苜蓿草、豆粕；动物性蛋白占比10%，包含秘鲁鱼粉、美国鸡肉粉；预混料占比10%，包含动物预混料、谷朊粉、碳酸氢钙、石粉、色拉油、饲料级氯化钠、饲料级氯化镁。其营养水平见表1。

表1 营养水平(干物质基础) %

1.4 试验样品采集试验第50 天早上9:00，将4组SD大鼠空腹称体质量，并每组分别随机抽取3只，用10%水合氯醛腹腔麻醉后取出SD大鼠心脏，将心脏表面血液用生理盐水清洗干净，滤纸吸干后置于液氮中保存待检。

1.5 SD大鼠心肌组织ROS活性测定按试剂盒说明书制备SD大鼠心肌组织单细胞悬液，使用DCFH-DA荧光探针，采用荧光酶标仪在激发波长和发射波长分别为500，525 nm处检测各组SD大鼠心肌组织中ROS的活性。

1.6 SD大鼠心肌组织抗氧化指标测定取出SD大鼠心肌组织样品自然解冻后，在提前预冷的生理盐水中漂洗，除去血液，滤纸擦干，称取0.1 ～0.2 g于研钵中，按质量(g)∶体积(mL)=1∶9的比例加入9倍体积的生理盐水，冰浴条件下，制备成10%的组织匀浆。按前述处理制备各组SD大鼠心肌组织匀浆，随后分别按照试剂盒说明书分别采用TBA法于532 nm处检测 MDA 含量，WST-1法于450 nm 处检测 SOD 活性，比色法于412 nm处检测GSH-Px活性，钼酸铵法于405 nm处检测CAT含量，考马斯亮蓝法检测组织蛋白浓度。

1.7 SD大鼠心肌线粒体功能相关指标测定称取约0.1 g SD大鼠心肌组织，加入1.0 mL提取液，用研钵于冰上匀浆。4℃、600×g离心10 min。将上清液移至另一离心管中，4℃、 11 000×g离心15 min。在上清及沉淀中分别加入 1.0，0.4 mL提取液，超声波破碎，用于复合体Ⅰ、Ⅲ活性测定，并且用于蛋白含量测定。然后采用比色法，按照试剂盒说明书进行各组SD大鼠心肌线粒体呼吸链复合体Ⅰ、Ⅲ活性的检测。

1.8 SD大鼠心肌能量代谢相关指标测定准确称取SD大鼠心肌组织质量，按质量(g)∶体积(mL)=1∶9的比例，加入生理盐水，冰浴条件下机械匀浆，2 500 r/min离心10 min，取上清(即10%的匀浆上清液)，再用生理盐水10倍稀释成1%，同时用考马斯亮蓝法检测组织蛋白浓度。随后按照试剂盒说明书进行处理，通过定磷法检测各组SD大鼠心肌组织 Na+-K+-ATP 酶、Ca2+-ATP 酶活性。

1.9 SD大鼠心肌组织低氧适应基因mRNA及蛋白表达测定

1.9.1qRT-PCR检测SD大鼠心肌组织低氧适应基因的mRNA表达 取-80℃冻存的SD大鼠心肌组织，用TRNzol Universal 总 RNA 提取试剂盒分别提取各组大鼠心肌组织总RNA并进行RNA完整性及浓度检测，随后按照cDNA反转录试剂盒操作说明书将RNA反转录为cDNA，最后采用SYBR PrimescriptTM试剂盒进行定量PCR分析。试验每组3个重复，根据公式2-△△Ct计算所测基因的相对表达量。

表2 引物信息

1.9.2免疫组化法检测SD大鼠心肌组织低氧适应基因的蛋白表达 大鼠心肌组织切片脱蜡至水，微波炉中火8 min至沸，停火8 min保温再转中低火7 min 修复抗原，3%双氧水溶液室温孵育25 min消除内源性过氧化物酶活性，滴加3% BSA 封闭30 min，分别滴加HIF-1α(1∶200)、EPO(1∶900) 和VEGF(1∶100) 抗体，4℃孵育过夜，滴加二抗室温孵育50 min，滴加 DAB 显色剂显色，复染，乙醇脱水，二甲苯透明，封片，显微镜下观察。苏木素染细胞核为蓝色，DAB显出的阳性表达为棕黄色。使用图像分析软件Image-Pro Plus 6.0对阳性表达产物进行平均光密度值分析。

1.10 数据分析试验数据采用统计软件 SPSS 21.0 进行统计分析，采用One-Way ANOVA单因素方差分析方法进行分析，Duncan's法进行多重比较，以P<0.05为差异显著，P<0.01为差异极显著，采用GraphPad Prism 8.0绘图软件进行绘图。

2 结果

2.1 低氧环境下CA对SD大鼠心肌组织ROS活性的影响由图1可知，与对照组相比，10 mg/kg组显著降低ROS活性(P<0.05)，20，40 mg/kg组极显著降低ROS活性(P<0.01)。试验组间结果显示，与10 mg/kg组相比，40 mg/kg组极显著降低ROS活性(P<0.01)；与20 mg/kg组相比，40 mg/kg组显著降低ROS活性(P<0.05)。其余组间差异不显著(P>0.05)。

*P<0.05,**P<0.01

2.2 低氧环境下CA对SD大鼠心肌组织抗氧化指标的影响由图2可知，与对照组相比，40 mg/kg组显著降低MDA含量(P<0.05)。试验组间结果显示，40 mg/kg组显著降低MDA含量(P<0.05)(图2A)。与对照组相比，20 mg/kg组显著提高SOD活性(P<0.05)，40 mg/kg组极显著提高SOD活性(P<0.01)。试验组间结果显示，40 mg/kg组显著提高SOD活性(P<0.05)(图2B)。与对照组相比，20，40 mg/kg组极显著提高GSH-Px活性(P<0.01)；试验组间结果显示，与10 mg/kg组相比，20，40 mg/kg组极显著提高GSH-Px活性(P<0.01)；与20 mg/kg组相比，40 mg/kg组显著提高GSH-Px活性(P<0.05)(图2C)。与对照组相比，20，40 mg/kg 组极显著提高CAT活性(P<0.01)。试验组间结果显示，20 mg/kg组显著提高CAT活性(P<0.05)，40 mg/kg组极显著提高CAT活性(P<0.01)。其余组间差异不显著(P>0.05)(图2D)。

A.MDA含量的变化；B.SOD活性的变化；C.GSH-Px活性的变化；D.CAT活性的变化。*P<0.05,**P<0.01

2.3 低氧环境下CA对SD大鼠心肌线粒体功能相关指标的影响结果显示，与对照组相比，10 mg/kg组显著提高呼吸链复合体Ⅰ活性(P<0.05)，20，40 mg/kg组极显著提高呼吸链复合体Ⅰ活性(P<0.01)，试验组间差异不显著(P>0.05)(图3A)。与对照组相比，不同剂量CA组极显著提高呼吸链复合体Ⅲ活性(P<0.01)；试验组间结果显示，20，40 mg/kg 组极显著提高呼吸链复合体Ⅲ活性(P<0.01)。其余组间差异不显著(P>0.05)(图3B)。

A.心肌线粒体呼吸链复合体Ⅰ活性的变化；B.心肌线粒体呼吸链复合体Ⅲ活性的变化。*P<0.05,**P<0.01

2.4 低氧环境下CA对SD大鼠心肌组织能量代谢相关指标的影响结果显示，与对照组相比，40 mg/kg 组极显著提高Na+K+-ATP酶活性(P<0.01)。试验组间结果显示，与10 mg/kg组相比，40 mg/kg组极显著提高Na+K+-ATP酶活性(P<0.01)；与20 mg/kg组相比，40 mg/kg组显著提高Na+K+-ATP酶活性(P<0.05)(图4A)。与对照组相比，20，40 mg/kg组显著提高Ca2+-ATP 酶活性(P<0.05)。试验组间结果显示，20，40 mg/kg组显著提高Ca2+-ATP 酶活性(P<0.05)。其余组间差异不显著(P>0.05)(图4B)。

A.Na+K+-ATP酶活性的变化；B.Ca2+-ATP 酶活性的变化。*P<0.05,**P<0.01

2.5 低氧环境下CA对SD大鼠心肌组织低氧适应基因mRNA及蛋白表达的影响

2.5.1低氧环境下CA对SD大鼠心肌组织低氧适应基因mRNA表达的影响 结果显示，与对照组相比，20，40 mg/kg组极显著促进HIF-1α的mRNA表达(P<0.01)。试验组间结果显示，20，40 mg/kg组极显著促进HIF-1α的mRNA表达(P<0.01)(图5A)。与对照组相比，不同剂量CA组极显著促进EPO的mRNA表达(P<0.01)。试验组间结果显示，与 10 mg/kg组相比，40 mg/kg组极显著促进EPO的mRNA表达(P<0.01)；与20 mg/kg组相比，40 mg/kg组显著促进EPO的mRNA表达(P<0.05)(图5B)。与对照组相比，10，20 mg/kg组显著促进VEGF的mRNA表达(P<0.05)， 40 mg/kg组极显著促进VEGF的mRNA表达(P<0.01)。其余组间差异不显著(P>0.05)(图5C)。

A.HIF-1α基因的mRNA表达情况；B.EPO基因的mRNA表达情况；C.VEGF基因的mRNA表达情况。*P<0.05,**P<0.01

2.5.2低氧环境下CA对SD大鼠心肌组织低氧适应基因蛋白表达的影响 由图6A结果可知，HIF-1α阳性表达的细胞核或细胞质中出现棕黄色颗粒，EPO阳性表达的细胞质中出现棕黄色颗粒，VEGF阳性表达的细胞膜或细胞浆中出现棕黄色颗粒。与对照组相比，20 mg/kg组显著促进HIF-1α的蛋白表达(P<0.05)，40 mg/kg组极显著促进HIF-1α的蛋白表达(P<0.01)；试验组间结果显示，40 mg/kg组显著促进HIF-1α的蛋白表达(P<0.05)。与对照组相比，20，40 mg/kg组极显著促进EPO的蛋白表达(P<0.01)；试验组间结果显示，40 mg/kg组显著促进EPO的蛋白表达(P<0.05)。与对照组相比，10 mg/kg组极显著促进VEGF的蛋白表达(P<0.01)，20，40 mg/kg组显著促进VEGF的蛋白表达(P<0.05)。其余组间差异不显著(P>0.05)(图6B)。

A.HIF-1α、EPO、VEGF的阳性表达情况；B.HIF-1α、EPO、VEGF的平均光密度值。*P<0.05,**P<0.01

3 讨论

3.1 低氧环境下CA对SD大鼠心肌组织ROS活性的影响ROS是机体内一类氧的单电子还原物，包括H2O2、O2-等，可参与血管内皮细胞通透性的调节过程[10]。一定量的ROS有利于机体的自身调节，正常环境下，ROS产生后会被相应的自由基清除剂清除，使其在机体内保持稳定的状态。当机体受到低氧等刺激时，组织器官中ROS产生过多导致自由基清除剂不能完全清除而使其大量蓄积，从而引起脂质过氧化、线粒体功能损伤等[11-12]。本研究结果表明，与对照组相比，10 mg/kg组ROS活性显著降低(P<0.05)，20，40 mg/kg组ROS活性极显著降低(P<0.01)。试验组间结果表明，40 mg/kg组ROS活性显著降低(P<0.05)。表明低氧可能引起SD大鼠心肌组织ROS过量产生，导致心肌损伤，而CA可通过降低ROS活性起到缓解心肌损伤的作用，且40 mg/kg组作用效果最好。

3.2 低氧环境下CA对SD大鼠心肌组织抗氧化指标的影响MDA是脂质过氧化反应的终产物，具有细胞毒性，其含量变化不仅能反映ROS生成量还能间接反映机体低氧损伤的程度[2]。有研究表明，机体发生氧化应激时血清MDA含量升高[13]。SOD是生物体系中抗氧化酶系的主要成员之一，是机体内重要的抗氧化酶，具有特殊的生理活性，可清除体内多余的ROS，拮抗因ROS大量升高对机体造成的损伤[14]。GSH-Px、CAT是机体中广泛存在的重要的过氧化物分解酶，亦是反映机体抗氧化能力的关键指标，具有清除ROS的作用[15-16]。本研究结果表明，与对照组相比，低氧环境下不同剂量CA组显著降低MDA活性(P<0.05)，20，40 mg/kg组显著提高SOD、GSH-Px、CAT活性(P<0.05)。试验组间结果表明，40 mg/kg组显著降低MDA含量(P<0.05)，显著提高SOD活性(P<0.05)，极显著提高GSH-Px、CAT活性(P<0.01)。说明低氧可能引起ROS过量产生进而导致SD大鼠心肌组织脂质过氧化损伤，而CA可通过增强SD大鼠心肌组织抗氧化能力，减弱脂质过氧化程度及ROS活性，增强SD大鼠心肌组织的低氧适应能力，且40 mg/kg 组作用最佳。

3.3 低氧环境下CA对SD大鼠心肌线粒体功能相关指标的影响线粒体是组织细胞内氧化磷酸化和ATP产生的主要场所，是心肌细胞最重要的细胞器，在维持心肌正常生命活动方面具有重要作用。线粒体呼吸链复合体Ⅰ、Ⅲ是ROS产生的主要部位，长期低氧引起机体内多种抗氧化机制破坏，ROS生成增加导致线粒体呼吸链复合体Ⅰ、Ⅲ活性降低，从而影响线粒体功能[17]。王延玲[18]研究证明，3 400 m 的高海拔环境下应用药物美托洛尔后能通过提高大鼠心肌线粒体呼吸链复合体活性来减弱ROS产生，缓解低氧损伤。程岩岩等[19]研究证明，中药健脾化痰祛瘀方能增加心肌线粒体呼吸链复合体活性，维持氧化磷酸化的功能，保护心脏。本研究结果表明，与对照组相比，低氧环境下不同浓度CA均可显著提高心肌线粒体呼吸链复合体Ⅰ、Ⅲ活性(P<0.05)。试验组间结果表明，20，40 mg/kg组极显著提高呼吸链复合体Ⅲ活性(P<0.01)，40 mg/kg 组活性最高。揭示低氧可能引起ROS过量产生进而导致SD大鼠心肌线粒体功能障碍，而CA可通过促进线粒体呼吸链复合体Ⅰ、Ⅲ活性抑制ROS产生，改善SD大鼠心肌线粒体功能，增强SD大鼠的低氧适应。

3.4 低氧环境下CA对SD大鼠心肌能量代谢相关指标的影响ATP酶主要存在于组织细胞膜及细胞器膜上，是生物膜上的关键蛋白酶。其功能主要是催化ATP水解为ADP和磷酸，并释放能量满足机体生命活动所需[20]。ATP酶主要有Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶。Na+-K+-ATP酶主要表达于细胞膜，Ca2+-ATP酶在细胞膜和肌浆网均有表达。心肌缺氧时，ATP生成迅速减少，钠泵活性降低，慢钠通道増加，导致细胞内钠离子增多。同时，Ca2+-ATP酶活性受到抑制，使心肌细胞内外钙离子失衡，最终导致心肌损伤。因此，保持Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶活性能更好的维持细胞内Na+、Ca2+浓度的稳定，在低氧下起到增强心肌适应性的作用[21-23]。本试验结果表明，与对照组相比，低氧环境下40 mg/kg组极显著提高Na+-K+-ATP酶活性(P<0.01)，20，40 mg/kg组显著提高Ca2+-ATP酶活性(P<0.05)。试验组间结果表明，40 mg/kg 组极显著提高Na+K+-ATP酶活性(P<0.01)，20，40 mg/kg组显著提高Ca2+-ATP 酶活性(P<0.05)。阐明低氧可能引起SD大鼠心肌组织能量代谢障碍，而CA可通过提高SD大鼠心肌组织Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶的活性，维持心肌内外离子平衡，改善能量代谢，增强心肌组织的低氧适应性，且40 mg/kg组作用效果最佳。

3.5 低氧环境下CA对SD大鼠心肌组织低氧适应基因mRNA及蛋白表达的影响HIF-1α对机体缺氧具有敏感的特异性，对维持体内氧气稳态具有重要的作用。EPO基因是最早发现的与低氧适应相关的基因，可通过促进红细胞生成调节血液携氧能力，缓解机体缺氧情况。有研究表明，当机体供氧不足时，EPO基因的表达量显著增加[24]。VEGF在机体血管生成和血管重塑中起重要作用，VEGF可作用于血管内皮细胞，使缺氧组织周围的血管新生，从而改善组织缺氧损伤情况[25]。EPO和VEGF是HIF-1α的标志性靶基因，在缺氧环境下，HIF-1α通过促进EPO、VEGF的转录与表达，从而促进红细胞生成，提高组织携氧能力，增加血管的新生能力，减少组织缺氧造成的损伤，从而对心肌缺氧起到代偿的保护作用[26-27]。本试验结果表明，与对照组相比，低氧环境下CA可显著促进低氧适应基因HIF-1α、EPO、VEGF的mRNA及蛋白表达(P<0.05)。试验组间结果显示，40 mg/kg组极显著促进HIF-1α、EPO的mRNA表达(P<0.01)，显著促进HIF-1α、EPO的蛋白表达(P<0.05)。说明CA可通过作用于HIF-1α来调控EPO及VEGF的表达，提高组织携氧能力及血管新生能力，进而增强动物机体低氧条件下的生存能力，且40 mg/kg组作用最好。

综上所述，CA可通过抑制SD大鼠心肌组织ROS活性，提高其抗氧化能力、线粒体功能、能量代谢水平及低氧适应能力，增强SD大鼠心肌组织低氧适应性，且以40 mg/kg组作用最佳。为解析CA对SD大鼠心肌组织低氧适应潜在的影响作用及缓解高海拔地区动物低氧应激提供新思路。