agr 系统在单核增生细胞李斯特菌耐药及生物被膜形成中的作用

任思雨 姜聪一 于涛 康瑞 姜晓冰

（1. 河南师范大学生命科学学院，新乡 453007；2. 新乡学院生命科学与基础医学学院，新乡 453000）

单核细胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes,Lm）是一种常见的食源性致病菌，广泛存在于食品以及食品加工环境中［1］。Lm 是人畜共患病李斯特菌病（listeriosis）的病原菌，可造成孕妇、新生儿和老年人等免疫力低下人群的感染。随着抗生素、消毒剂等在临床和食品加工过程中的广泛应用，Lm对这些抗菌药物的耐药性逐渐增强［2］。Lm 能够在不同的食品接触面形成生物被膜，处于被膜状态的Lm 对外界不利条件的抵抗力更强，因此普通的消毒杀菌难以有效清除Lm 生物被膜。Lm 生物被膜在食品加工环境中的存在增加了食品被Lm 污染的几率，对食品安全造成了严重的威胁［3］。

群体感应（quorum sensing, QS）是细菌细胞间化学通讯的过程。细菌产生并释放一种被称为自诱导剂的细胞外信号分子，自诱导剂的浓度随着细胞密度的增加同步增加，当达到一定阈值时会启动相关基因的表达［4］。QS 参与调控细菌多种重要生理行为［5］，如生物发光、生物被膜的形成、次级代谢产物产生、DNA 摄取能力和毒力因子的产生等。

目前研究者已在Lm 中发现两个QS 系统，即LuxS 系统［6］和Agr 系统［7］，其中Agr 系统仅存在于一些革兰氏阳性菌中。Lm 的agr是由agrBDCA组成的操纵子，分别编码前体加工酶AgrB、前体肽AgrD、组氨酸蛋白激酶AgrC 和反应调控子AgrA。Lm 产生的前体肽AgrD 经膜蛋白AgrB 的加工修饰成为具有活性的信号分子——自诱导肽（autoinducing peptide, AIP）并释放到胞外。当AIP 达到一定浓度后会与细胞膜上的AgrC 结合同时触发级联磷酸化反应，磷酸化的AgrA 与下游的靶基因启动子结合进而调控相关基因的表达（图1）。研究发现，agrA的缺失导致Lm 菌株生物被膜形成能力降低［8］；agrD可能参与Lm 的侵袭、生物被膜形成以及几丁质酶的表达［9-11］。agrC在Lm 生物被膜形成中的作用仍不清楚。此外，agr系统在Lm 对抗菌药物耐药中的作用也尚未见报道。

图1 Lm 中的agr 系统Fig. 1 agr system in L. monocytogenes

本研究以Lm 标准菌株EGD-e 为研究对象构建agr系统基因缺失突变株ΔagrB/D、ΔagrC和ΔagrA，通过比较野生株和突变株在耐药性、生物被膜形成能力和运动性方面的差异，调查agr系统在Lm 对抗菌药物耐药及生物被膜形成中的作用。

1 材料与方法

1.1 材料

Lm 标准菌株EGD-e 由华中师范大学罗勤教授惠赠；大肠杆菌DH5α 感受态，BIOGENE；穿梭质粒pMAD，本实验保存；突变株EGDeΔagrC，本实验室保存；苯扎氯铵（benzalkonium chloride, BC），国药集团化学试剂有限公司；结晶紫，天津市大茂化学试剂厂；草酸铵，北京化工厂，细菌基因组DNA 提取试剂盒，RealMaster Mix（SYBR Green）试剂盒，天根生化科技有限公司；高保真PCR 酶、Taq 酶和dNTPs，TaKaRa 公司；细菌RNA 提取试剂盒，Omega 公司；质粒小提试剂盒、胶回收试剂盒、限制性内切酶、T4 DNA 连接酶，Thermo 公司。

脑心浸液培养基（brain heart infusion, BHI），OXOID 公司；胰蛋白胨大豆肉汤培养基（tryptic soy broth, TSB），北京索莱宝科技有限公司；LB 培养基（g/L）：酵母提取物5.0，胰蛋白胨10.0，NaCl 10.0；0.5%草酸铵-结晶紫溶液：A 液：1 g 结晶紫溶于20 mL 95%的乙醇溶液中，B 液：用80 mL 蒸馏水溶解0.8 g 草酸铵，使用时将A 液与B 液混匀，静置72 h。

基因扩增仪，北京东胜创新生物科技有限公司；凝胶成像分析系统、电转仪、酶标仪，Bio-Rad 公司；实时荧光定量PCR 仪，ABI 公司；恒温培养箱，北京科伟永兴仪器有限公司；微生物全自动生长曲线分析仪，Oy Growth Curves Ab 有限公司；倒置显微镜，Leica 公司。

1.2 方法

1.2.1 基因缺失突变株的构建 使用细菌基因组试剂盒提取Lm 野生株EGD-e 的DNA，利用 SOE-PCR技 术（splicing by overlap extension PCR, SOE-PCR），以EGD-e 基因组DNA 为模板使用引物对P1 和P2、P3 和P4（引物序列见表1）分别扩增目的基因的上、下游同源臂，融合后得到的长片段经酶切纯化后与载体pMAD 连接。将重组质粒转化至大肠杆菌DH5α 中，筛选出阳性克隆菌株并测序。将测序正确的重组质粒电转至EGD-e 感受态中，在红霉素和高温的双重压力下筛选出基因缺失突变株。

表1 PCR 扩增引物序列Table 1 Primer sequences for PCR amplification

1.2.2 最低抑菌浓度（minimum inhibitory concentration, MIC）值测定 根据临床实验室标准协会（clinical and laboratory standards institute, CLSI）推荐的微量肉汤稀释法测定菌株对10 种抗菌药物的MIC 值。

1.2.3 生长曲线测定 将培养至对数期（OD600为0.5-0.6）的菌液按1∶100 的比例分别转接至新鲜的BHI 和含有1 μg/mL BC 的BHI 中。取200 μL 稀释菌液转移至100 孔的检测板中，置于微生物全自动生长曲线分析仪中，37℃培养48 h，每15 min 测定一次OD600。

1.2.4 致死曲线测定 将待测菌株培养至对数期（OD600为0.5-0.6），取1 mL 菌液离心（8 000 r/min,5 min），离心后弃去上清，使用新鲜的5 mL BHI+BC（16 μg/mL）培养基重悬菌体，37℃培养，分别在0、10、20、30 和40 min 时取100 μL 的菌液进行梯度稀释涂板，在37℃培养24 h 后计数。

1.2.5 生物被膜定量及观察 从平板上挑取单克隆接种于新鲜的BHI 培养基中37℃振荡过夜培养。次日取过夜菌液按1%的比例接种至新鲜的BHI 培养基内，待其培养至对数期（OD600为0.6-0.8）时，取1 mL 菌液离心（8 000 r/min, 5 min）、重悬，取重悬菌液按1%的比例稀释至BHI 中，吸取1.2 mL 稀释后的菌液加入到24 孔板中，分别在37℃、20℃和4℃下培养生物被膜。

生物被膜的定量：小心弃去孔中的培养基，使用无菌PBS 缓冲液冲洗24 孔板以去除浮游细菌，室温下风干40 min 后，向每个孔中加入的0.5%结晶紫染液，溶液染色30 min；弃去孔中染液，用无菌水洗涤4-6 次，室温干燥；加入95%的乙醇在37℃下孵育30 min，最后使用酶标仪检测OD595值。

测定OD595后，弃去孔中的脱色液并置于室温下干燥，直接使用倒置显微镜（放大倍数为60 倍）观察生物被膜，并拍照记录。

1.2.6 运动性测定 采用软平板法测定菌株的运动性。群集运动性软平板含0.5%琼脂，泳动运动性平板含0.3%琼脂。待测菌株在TSB 培养基中于37℃振荡过夜培养；次日按1%的比例接种至新鲜的TSB 培养基中，继续培养至对数期，取1 μL 稀释后的菌液接种于平板中心，在室温下放置30 min 待菌液吸收后，于25℃静置培养24 h，之后用游标卡尺测定菌圈直径。

1.2.7 RT-qPCR 检测相关基因转录水平 按照细菌RNA 提取试剂盒提取细菌总RNA。使用反转录试剂盒将总RNA 反转录为cDNA。以cDNA 为模版，使用RealMaster Mix 试剂盒进行RT-qPCR，以16S rRNA 为参照基因。以野生株EGD-e 的基因转录水平为对照。

1.2.8 数据统计分析 使用SPSS 23.0 统计软件对实验数据进行t检验分析，P<0.05 则差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 基因缺失突变株的构建与分子鉴定

使用引物1-4 分别扩增agrB/D和agrA的上下游同源臂，通过SOE-PCR 得到融合片段（图2-A）。融合片段与pMAD 质粒连接获得重组质粒，双酶切验证结果如图2-B 所示。将测序结果正确的重组质粒电转至Lm 感受态细胞，高温和抗生素双重压力筛选突变株（图2-C）。测序结果显示成功缺失agrB/D和agrA，获得基因缺失突变株ΔagrB/D和ΔagrA。

图2 agrA 和agrB/D 基因缺失株的构建Fig. 2 Construction of ∆agrA and ∆agrB/D

2.2 抗菌物质对Lm菌株的MIC值

如表2 所示，3 株缺失突变株对氨苄西林、头孢噻吩、红霉素、卡那霉素、四环素、氯霉素、乳酸链球菌素以及BC 的MIC 值与野生株无差异。与野生株相比，ΔagrA对头孢噻肟的MIC 值下降，ΔagrB/D和ΔagrC对 环 丙 沙 星 的MIC 值 降 至0.5 μg/mL。

表2 抗菌物质对Lm 菌株的MIC 值Table 2 MICs of antimicrobial agents against L. monocytogenes

2.3 BC胁迫下Lm的生长曲线和致死曲线

生长曲线结果如图3 所示。野生株与3 株突变株在BHI 中的生长无差异；当BC 浓度为1 μg/mL时，与野生株相比，ΔagrC的生长完全受到抑制；ΔagrB/D的延迟期明显变长；而ΔagrA的生长延迟期则明显变短（表3）。

表3 生长曲线分析Table 3 Growth curve analysis

图3 Lm 的生长曲线Fig. 3 Growth curves of L. monocytogenes

由图4 可知，当BC 浓度为16 μg/mL 时，暴露10 min 后野生株的存活率为49.12%；ΔagrC、ΔagrA和ΔagrB/D 的存活率均低于野生株，分别为33.83%、26.29%和14.12%。暴露30 min 后，野生株的存活率为17.9%，而所有突变株的存活率则趋近于0。

图4 Lm 对BC 的致死曲线Fig. 4 Death curves of L. monocytogenes exposed to BC

2.4 Lm生物被膜形成能力

37℃培养条件下Lm 生物被膜形成如图5 和表4 所示。在培养1、2 和3 d 的过程中，ΔagrA和ΔagrB/D在各个时间段的生物被膜形成量均明显低于野生株；ΔagrC的生物被膜量在培养3 d 后显著下降（图5-A）。倒置显微镜观察培养2 d 后野生株和基因缺失株的被膜结构如图5-B 所示，野生株形成的生物被膜结构完整致密，生物量多，而agr缺失突变株形成的生物被膜结构疏散，生物量少。

表4 野生株和突变株在37℃下形成的生物被膜量Table 4 Biofilm biomasses of wild type and mutant strains at 37℃

图5 Lm 菌株在37℃下形成的生物被膜Fig. 5 Biofilm formation of L. monocytogenes strains at 37℃

20℃培养条件下Lm 生物被膜形成如图6 和表5 所示。只有在培养3 d 后，ΔagrA、ΔagrB/D和ΔagrC的生物被膜形成量均明显低于野生株。倒置显微镜观察培养6 d 后野生株和基因缺失株的被膜结构如图6-B 所示，野生株形成的生物被膜结构相对完整致密，生物量多，而agr缺失突变株形成的生物被膜结构疏散，网状结构明显，生物量少。

表5 野生株和突变株在20℃下形成的生物被膜量Table 5 Biofilm biomasses of wild type and mutant strains at 20℃

图6 Lm 菌株在20℃下形成的生物被膜Fig. 6 Biofilm formation of L. monocytogenes strains at 20℃

4℃培养条件下Lm 生物被膜形成如图7 和表6 所示。在培养10、20 和30 d 的过程中，ΔagrA、ΔagrB/D和ΔagrC在各个时间段的生物被膜形成量均明显低于野生株（图7-A）。倒置显微镜观察培养20 d 后野生株和基因缺失株的被膜结构如图7-B 所示，野生株形成的生物被膜结构完整致密，孔隙少，生物量多，而agr缺失突变株形成的生物被膜结构疏散，孔隙大，生物量少。

表6 野生株和突变株在4℃下形成的生物被膜量Table 6 Biofilm biomasses of wild type and mutant strains at 4℃

图7 Lm 菌株在4℃下形成的生物被膜Fig. 7 Biofilm formations of L. monocytogenes strains at 4℃ 20 d

2.5 运动性检测结果

由图8-A 可知，突变株的泳动能力与野生株无明显差异；由图8-B 可知，ΔagrC的群集运动能力显著高于野生株。

图8 野生株与agr 基因缺失突变株的泳动和群集运动性Fig. 8 Swimming and swarming of the wild-type strain and agr gene deletion mutants

2.6 运动相关基因的转录水平

由图9 可知，与野生株相比，motB在ΔagrB/D中的转录水平显著下调；flaA在ΔagrA、ΔagrB/D和ΔagrC中的转录水平均显著下降，分别为0.38 倍、0.09倍和0.54 倍。

图9 野生株与agr 基因缺失突变株中运动相关基因的转录水平Fig. 9 Transcription levels of motility-associated genes in the wild type and agr gene deletion mutants

3 讨论

除了头孢噻肟和环丙沙星，3 株突变株对其余抗菌药物的MIC 值均与野生株相同。考虑到微量肉汤法的灵敏度可能不足以反映突变株和野生株的耐药表型差异，本研究又调查了这些菌株在亚抑菌浓度抗菌药物作用下的生长曲线。结果显示，野生株与突变株仅在亚抑菌浓度BC 胁迫下的生长出现明显差异。BC 属于季铵盐类化合物，是一种高效广谱的消毒剂，主要用于食品加工环境、食品生产用具设备、食品贮藏环境及工业水的消毒杀菌［12-14］。生长曲线结果表明，当BC 的浓度为1 μg/mL 时，ΔagrC的生长完全受到抑制，ΔagrB/D的生长延迟期明显变长，表明agrB/D和agrC与Lm 对BC 耐药有关，并且agrC在Lm 对BC 耐药中发挥更大的作用。缺失agrB/D后agrCA的存在仍能保证菌株在亚抑菌浓度BC 下生长，据此推测组氨酸蛋白激酶AgrC 可能会感应到胞外BC 的存在，并通过磷酸化反应将信号传递至胞内；而当agrC缺失后，AIP 无法通过与AgrC 结合激活agr系统，同时细胞也无法感应胞外BC 的存在，因此ΔagrC在亚抑菌浓度BC 下无法生长。相反地，agrA的缺失促进了Lm 在BC 胁迫下的生长，这可能是由于在ΔagrA中AgrC 与其他的反应调控子发生信号串联所致。本研究还调查了Lm在致死浓度BC 作用下的生长。致死曲线结果表明，3 株突变株在不同时间点的存活率均低于野生株。以上结果表明，agr系统参与Lm 对BC 耐药。需要指出的是，本研究利用框内敲除构建了agr突变体，但是没有构建相应的回复突变株。在后续研究中将会构建回复突变株以排除基因敲除的极性效应。

生物被膜是细菌定植在固体表面的一种常见状态［15］。生物被膜的形成给细菌在不利环境中的生长提供了保护，导致消毒剂等抗菌物质无法杀灭被膜内部的细菌，给食品加工造成安全隐患［16-18］。温度是影响细菌生物被膜形成的重要环境因素，因此本研究调查了Lm 野生株和突变株在不同温度下的生物被膜形成能力。37、20 和4℃分别代表人体内的温度、食品加工环境的温度和食品冷藏的温度。在37℃条件下，ΔagrC的生物被膜量在培养1 和2 d时与野生株相比没有差异，而到第3 d 后显著下降，表明agrC可能在Lm 生物被膜形成后期发挥作用。在20℃条件下，3 株突变株与野生株生物被膜形成能力的差异仅在培养前期较为明显。在37℃和4℃条件下，与野生株相比，突变株的生物被膜形成能力降低。总体来说，agr系统参与Lm 在不同温度条件下的生物被膜形成。

在生物被膜形成的初期，浮游细菌可在自身鞭毛的作用下接触到物体表面，鞭毛介导的运动性可以使菌体聚集，促进生物被膜的形成［19］。由鞭毛介导的泳动运动性与群集运动性与细菌生物被膜的形成密切相关。泳动运动性是细菌个体而非合作性的运动行为，而群集运动性则是一种群体运动行为。运动性增强可能会促进细菌生物被膜形成，但两者之间并没有绝对的正相关关系［20-21］。本研究结果表明agr系统与Lm 泳动运动性无关。缺失agrC后，菌株的群集运动能力显著性增强，而运动相关基因motB和flaA在∆agrC中的转录水平却显著下调，这表明agrC的缺失可能导致其他运动性相关基因的转录水平升高，从而增强菌株的群集运动性。

Lm 是一种重要的食源性致病菌，随着杀生物剂的广泛使用，在食品及环境中分离出大量的耐受菌株，耐受菌株的出现给人类带来极大的安全挑战。QS 是细菌细胞间的通讯系统，也是细胞调控网络中重要系统。本研究的结果显示，与野生株相比，缺失agr系统导致Lm 对头孢噻肟、环丙沙星及BC 的敏感性增强；突变株生物被膜形成能力下降；缺失agr系统对Lm 的运动性没有显著影响。以上结果表明，agr系统在Lm 对抗菌药物耐药及生物被膜形成中发挥作用。

4 结论

本研究利用同源重组技术构建了agrA、agrB/D、agrC基因缺失突变株。与野生株相比，突变株对头孢噻肟、环丙沙星及BC 的耐药性降低；突变株在不同温度下的生物被膜形成能力降低。这些结果表明agr系统参与Lm 对抗菌药物的耐药以及生物被膜的形成。