高效液相色谱法同时定量分析紫苏不同部位的植物代谢物

张红玉，王丹，吴春剑，侯天宇，赵亚娜，张志军，雷娜娜，李河*

（1.中北大学化学与化工学院，山西太原 030051）（2.华南理工大学食品科学与工程学院，广东广州 510641） （3.香港中文大学化学院，中国香港 999077）

紫苏（Perilla frutescensL.）是一种唇形科草本植物，是国家卫生部首批颁布的药食同源的60种中药之一[1]。在东南亚地区分布广泛，尤其在中国、日本、韩国种植历史更加悠久[2]。我国早有利用新鲜紫苏叶处理以避免食用虾蟹中毒的传统，日本将紫苏当做代表性的风味食品，韩国利用紫苏制作泡菜和烤肉包 装[3]，因此，紫苏在食品工业上应用广泛。

紫苏代谢物在其生长和自我防御机制中形成，主要包括黄酮类、脂肪酸类、酚酸类[4]、植物甾醇类及精油[5,6]，具有多种生理功能[3]。研究表明，紫苏提取物有极强的抗氧化性[7-9]。紫苏油可改善糖尿病性小鼠的高甘油三酸酯血症和肠道营养不良[10]、淀粉样蛋白β诱导的认知障碍[11]和炎症反应[12]；紫苏叶提取物对脂肪细胞分化和高脂饮食小鼠有抗肥胖作用[13]，也有降血糖活性[14]；紫苏醛可调节大鼠的α-抑制蛋白减轻其抑郁行为[15]；紫苏籽多糖可抑制小鼠体内肿瘤细胞的生长[16]。

研究表明迷迭香酸是紫苏叶中含量最高的化合 物[3]。薛姣[17]分离纯化了紫苏迷迭香酸，并研究了它的抗氧化和抗菌性能；杨馥菡等[18]利用高速逆流色谱分离纯化了紫苏叶中的迷迭香酸和咖啡酸。何彦康[19]利用高效液相色谱-二极管阵列（HPLC-DAD）、高效液相色谱-质谱法（HPLC-MS）以及核磁共振光谱（NMR）确认了紫苏中花色苷和主要黄酮类物质的结构；Assefa等[9]利用超高效液相色谱-电喷雾电子-飞行时间-质谱技术（UPLC-ESI-TOF-MS）定性分析了73种紫苏样品中酚类化合物。Yan等[7]提取测定了冷榨紫苏子粉中的总多酚含量，并评估了其中的抗氧化性能；上述对紫苏代谢物的研究多基于色谱-质谱联用技术，且以定性为主。在对紫苏代谢物定量分析的研究中，史月姣等[20]和艾鑫卫等[21]利用LC-MS分别测定了紫苏水煎液和各生长期紫苏中的酚类物质含量；代沙等[22]利用HPLC测定了不同品系紫苏中的8种酚类物质；落艳娇等[23]测定了不同栽培年份和采收期紫苏叶中的2种酚酸和6种黄酮的成分含量。此外，5-羟甲基糠醛（HMF）和糠醛等呋喃环衍生物也被报道为植物代谢物，在中药中广泛存在[24,25]，然而在紫苏中的分布尚未见报道。

综上所述，目前对紫苏代谢物的研究主要集中在迷迭香酸、咖啡酸和部分黄酮上，原料以紫苏叶为主。鲜有报道紫苏杆、壳、叶中代谢物同时定量分析方法的研究。与HPLC-MS相比，HPLC价格相对便宜，在各高校实验室及公司研发质检部门普遍配备，因此，本实验以山西不同品种的紫苏为研究对象，利用HPLC法系统分析紫苏不同部位的19种代谢物的含量和分布，以期为紫苏代谢物的定量分析及相关产品开发提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

紫苏叶、紫苏杆、紫苏壳（山西省晋中市）均来源于本课题组实验田种植所得，品种分别为1#、3#、4#、27#、28#、混1#、晋紫苏2#、晋紫苏3#、白苏、双面紫。甲醇、乙腈、甲酸、乙酸均为色谱纯，均购自上海阿拉丁生化技术有限公司。无水乙醇、没食子酸（GA）、迷迭香酸（RosA）、芦丁（RT）购自北京索莱宝科技有限公司。5-羟甲基糠醛（HMF）、糠醛（F）、原儿茶酸（PCA）、对羟基苯甲酸（ρ-HBA）、儿茶素（C）、咖啡酸（CA）、对香豆酸（ρ-CA）、野黄芩苷（SG）、阿魏酸（FA）、杨梅素（MC）、白藜芦醇（RVT）、木犀草素（LTL）、槲皮素（QC）、芹菜素（AGN）、山奈酚（KMF）均购自上海阿拉丁生化技术有限公司，芹菜素-7-O-葡萄糖苷（AG）购自上海紫霞生物科技有限公司。19种植物代谢物的详细信息见表1。

表1 19种植物代谢物的详细信息Table 1 Detailed information of 19 plant metabolites

1.2 仪器与设备

Ultimate 3000高效液相色谱仪，美国热电公司；超高效液相色谱-飞行时间质谱仪，Aanquish超高效液相系统，TSQ Altis三重四极杆质谱，美国热电公司；SB25-12DTD超声波清洗器，宁波新芝生物科技股份有限公司；CTL550低速离心机，湖南湘立仪器有限公司；XW-80A涡旋混合器，上海驰唐电子有限公司；ZYCGF-III-20T超纯水制备系统，四川卓越水处理设备有限公司；BCD-576WDPU冰箱，海尔公司；RE-52AA旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂。

1.3 方法

1.3.1 标准品溶液制备

准确称取没食子酸、5-羟甲基糠醛、糠醛、原儿茶酸、对羟基苯甲酸、儿茶素、咖啡酸、对香豆酸、阿魏酸、芦丁、迷迭香酸、杨梅素、白藜芦醇、木犀草素、槲皮素和山奈酚标准品各20 mg，分别用甲醇溶解并定容到10 mL容量瓶中，得到每种标准品浓度为2 mg/mL的标准贮备液。利用含0.1%甲酸的乙腈水溶液（乙腈:水=1:1，V/V）对贮备液进行梯度稀释，得到一系列不同浓度梯度混合标准工作液，同时稀释各标准贮备液，得到单独标准品工作液。

1.3.2 色谱分析条件

采用高效液相色谱法对19种物质进行测定，其中单独标准品用于定性分析，混合标准品进行定量分析，色谱条件如下：（1）色谱柱：Atlantic C18柱（4.6 mm× 250 mm，5 μm）；（2）柱温，25 ℃；（3）流动相：A，0.1%甲酸乙腈、B，0.1%甲酸水；（4）洗脱程序：0~15 min，95%~90% B；15~30 min，90%~70% B；30~50 min，70%~60% B；50~51 min，60%~0% B；51~54 min，0% B；54~55 min，0~95% B；55~65 min，95% B。（5）进样量，20 μL；（6）流速，1.0 mL/min；（7）检测波长见表1。

1.4 未知物定性分析

经甲醇水溶液提取之后，样品色谱图中有2个色谱峰i和ii（图2b、2c、2d）与19种标品化合物的保留时间均对应不上，但其含量相对较高，为了进一步对这两种化合物进行定性分析，利用超高效液相色谱-飞行时间质谱联用法（UPLC-TOF-MS）对其质谱碎片离子进行确定，色谱条件同1.3.2，进入质谱时通过分流将流速设为0.3 mL/min，质谱条件如下：电喷雾电子（ESI）电离，负离子模式，全扫描，扫描范围：100~1 000m/z，离子传输管温度：300 ℃，雾化室温度：350 ℃，载气40 arb；辅助气：10 arb。

1.5 样品前处理

分别对不同品种紫苏叶、杆及壳取样，经自然风干后搅碎，然后过60目筛，得到各部位的粉末状样品，取样部位及样品见图1。准确称取0.50 g粉末样品至50 mL塑料离心管中，加入10 mL酸化甲醇水溶液（甲醇:水=60:40，0.1%甲酸），涡旋振荡1 min，超声萃取20 min后，5 000 r/min离心15 min，收集上清液。残渣继续用10 mL上述甲醇水溶液继续萃取1次，重复超声和离心步骤，收集上清液，过0.22 μm滤膜后，待HPLC分析。对于紫苏叶样品中的迷迭香酸，因其含量较高（出现平头峰，图2b），进样前需进行10倍稀释。

图1 紫苏取样部位图Fig.1 Sampling sites of Perilla

1.6 方法学考察

1.6.1 检出限与定量限

紫苏杆样品中加入混合标准溶液后得到信噪比（S/N）为3时对应的浓度为样品的检出限（LOD），以信噪比为10时对应的浓度为定量限（LOQ）。具体方法为：在紫苏杆样品中加入标准溶液，经过前处理之后，浓度为C，HPLC分析得到信噪比为n，则此时利用以下公式计算得到理论的LOD和LOQ：

注：

LOD——样品的检出限；

LOQ——定量限；

C——紫苏杆样品中加入标准溶液，经前处理之后的浓度；

n——信噪比。

以计算得到的LOD和LOQ为参考，加入浓度越来越低的标准溶液，直到实际测得信噪比为3或10时，对应的浓度即为实际的LOD和LOQ（实际值一般比理论值偏高）。

1.6.2 线性方程与范围

利用外标法对植物样品中19种物质进行定量。分别配置浓度为1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、50.0 mg/L的混合标准溶液，在1.3.2色谱条件下进样分析。以标准品浓度（x，mg/L）为横坐标，以峰面积（y）为纵坐标绘制标准曲线。由于各物质响应有差异，其对应的线性范围见表2。

1.6.3 回收率和精密度

精确称取紫苏杆样品0.50 g，加入19种混合标准品适量，使其浓度分别达到2.0、10.0和50.0 mg/L，每个浓度平行6次，各物质的回收率通过以下公式计算：

式中：

R——回收率，%；

m总——各物质加标和样品的总含量，mg；

m样品——样品本身各物质的含量，mg；

m加标——加入各物质的含量，mg。

回收率6次平行的相对标准偏差（RSD）作为方法的精密度。

1.7 统计分析

除了回收率平行6次外，其余结果均为三次检测均值±标准差表示。数据采用Excel 2019进行整理与初步分析，SPSS 21.0进行方差分析，Origin 2018进行作图以及拟合处理。置信区间为95%，即P＜0.05视为数据之间有显著性差异。

2 结果与分析

2.1 HPLC检测19种植物代谢物

采用HPLC对紫苏不同部位的19种植物代谢物进行检测，在1.3.2的色谱条件下，19种物质在55 min实现完全分离，峰型和分离度均较理想。三种紫苏不同部位的样品中，19种物质种类与含量的分布差异较大。图2为19种物质标准品和典型的紫苏叶、紫苏杆、紫苏壳样品液相色谱图。由图可知，在无需净化的过程中，样品中19种化合物的峰型干扰不影响定量积分。

图2 19种物质标准品及典型样品的液相色谱图Fig.2 HPLC chromatograms of 19 mixed standard compounds and typical samples

2.2 未知物的定性分析

如图2b、2c、2d所示，利用UPLC-TOF-MS对色谱峰i和ii进行定性分析，结果见图3。对于化合物i，负离子模式下，脱氢后质荷比为m/z637.151 00，未观察到可能的碎片离子，根据质谱信息与文献对 照[9,19]，判断i化合物为木犀草素-7-O-二葡萄糖苷；对于化合物ii，负离子模式下，脱氢后质荷比为m/z621.121 03，较高的碎片离子为m/z351.167 05，应为黄酮骨架上脱去一个葡萄糖苷酸基团（177 u）和一个苯酚基团（93 u），将其质谱信息与已发表的文献对比[4,9]，可确定化合物ii为芹菜素-7-O-二葡萄糖苷，由于这两种苷类物质的标准品很难商业购买，本文利用芹菜素-7-O-葡萄糖苷标准品对它们进行定量分析。

图3 两种未知物i和ii的TOF-MS图Fig.3 TOF-MS spectrum two unknown compounds: i and ii

2.3 提取溶剂的优化

由于纯有机试剂对待测物的溶解性大于流动相，使用纯有机试剂（如甲醇）对样品进行提取，会导致进入色谱柱的待测物在溶剂和流动相之间分配不均，出现部分物质色谱峰前置拖尾的现象，从而影响分离度。因此在对提取溶剂选择时，本文参照文献及课题组研究经验[23,26]，比较了甲醇、乙腈、乙醇水溶液（40%体积水）对19种待测物的提取回收率，结果见图4。如图4所示，三种溶剂对糠醛和杨梅素的回收率均较低，相比之下，甲醇水溶液更为理想。乙醇对对羟基苯甲酸、对香豆酸、迷迭香酸和白藜芦醇的回收率均超过100%，可能由于乙醇极性较低，提取了较多的杂质；乙腈对没食子酸和芦丁的回收率偏低；综上所述，本研究最终选择甲醇水溶液作为提取溶剂。

图4 三种溶剂对19种化合物回收率的影响（n=3）Fig.4 Effects of three extract solvents on the recoveries of 19 compounds (n=3)

2.4 方法学认证

2.4.1 检出限、定量限与标准曲线

根据1.6方法学考察，采用峰面积外标法定量，以质量浓度1.0、2.0、5.0、10.0、25.0和50.0 mg/L为横坐标，峰面积为纵坐标建立标准曲线，19种化合物的保留时间、检出限、定量限与标准曲线等信息见 表2。19种物质在线性范围内呈现较好的线性关系，相关系数在0.997 6~0.999 9之间，检出限在0.10~ 0.40 mg/L之间。史月姣等[20]利用LC-MS测定了紫苏水煎液的部分代谢物，但未报道检出限；艾鑫卫等[21]建立了高灵敏度的HPLC-MS测定紫苏不同生长期代谢物的方法，但仅能测定5种多酚，且质谱价格昂贵，较难普及。代沙等[22]建立了HPLC测定紫苏中分类的方法，也没有报道方法的检出限。虽然与LC-MS相比较，本研究的灵敏度较低，但仅就高效液相色谱而言，本方法具有更广泛的适用范围，能满足紫苏中代谢物定性和定量分析的要求。

表2 19种植物代谢物的保留时间、线性范围、线性方程、相关系数、检出限及定量限Table 2 Retention time, linear range and equation, correlation coefficient, limit of detection (LOD) and limit of qualification (LOQ) of 19 plant metabolites

2.4.2 回收率和精密度

由表3可知，19种植物代谢物的加标回收率在61.65%~111.42%之间，RSD在1.02%~17.20%之间。由于糠醛类物质粘度较大，且在紫苏中含量极少，在加标量较少时，其回收率较低。由于本文采用的HPLC法同时测定多种含紫外吸收基团的化合物，在提取中无法避免共洗脱的干扰，欧盟委员会规定，当加标量较低时，回收率在-50%到+20%之间可以接受[27]。因此，在没有质谱辅助的情况下，该方法在实验室及工业检测同时定量19种化合物时是可行的。

表3 19种化合物加标回收率和精密度（n=6）Table 3 Recoveries and precision of 19 compounds (n=6)

2.5 实际样品的检测

应用所建立的方法对10种不同品种紫苏的叶、壳、杆进行定量分析，检测结果见表4。通过对结果分析（图5），12种样品中，含量较大的化合物为咖啡酸、木犀草素-7-O-二葡萄糖苷、芹菜素-7-O-二葡萄糖苷、野黄芩苷、芹菜素-7-O-葡萄糖苷、迷迭香酸和芹菜素，在0.04~24.05 mg/g之间，含量差异跨度较大，不同紫苏部位的化合物含量分布也不同。结果显示，28#紫苏壳中共检出11种物质，含量在0.08~0.57 mg/g之间；21种化合物中，酚酸类如咖啡酸和迷迭香酸；黄酮及黄酮苷类，如木犀草素-7-O-二葡萄糖苷、芹菜素-7-O-二葡萄糖苷、野黄芩苷、芹菜素-7-O-葡萄糖苷和芹菜素在12种样品中均有检出，其中迷迭香酸为紫苏叶中含量最高的物质，这与前人的研究一致[17,28]，其次为野黄芩苷和芹菜素-7-O-葡萄糖苷。胡惠军等[26]报道了紫苏叶中咖啡酸、迷迭香酸和野黄芩苷的含量，其含量分别在0.10~0.49、0.29~9.58和0.26~4.38 mg/g之间；落艳娇等[23]测定了51个紫苏叶样品中咖啡酸、迷迭香酸和6种黄酮苷的含量，发现迷迭香酸含量为为2.13~33.97 mg/g；其次是木犀草素-7-O-二葡萄糖苷，含量为1.31~14.80 mg/g；芹菜素-7-O-二葡萄糖苷含量为2.68~7.60 mg/g；芹菜素-7-O-葡萄糖苷含量为0.56~1.00 mg/g；咖啡酸含量最少，为0.11~0.68 mg/g。造成含量差异的原因可能与紫苏品种、生成环境、水分含量及提取溶剂等有关。此外，本文中原儿茶酸和对羟基苯甲酸在部分样品中也有检出。木犀草素在紫苏壳和杆中有检出，含量较少，在0.05~0.18 mg/g之间，但在紫苏叶中没有检出。值得注意的是，本文在紫苏壳中检出了HMF和糠醛两种呋喃环衍生物。

表4 12种不同紫苏品种壳、叶、杆中植物代谢物的含量（n=3）Table 4 Contents of 21 studied compounds in seed shell, leaf and stem of 12 different types ofPerilla (n=3)

图5 21种化合物在不同品种紫苏不同部位的分布图Fig.5 Distribution of 21 compounds in different parts of different varieties of Perilla

3 结论

本实验基于高效液相色谱-紫外检测仪建立了不同品种紫苏不同部位中19种植物代谢物同时检测的方法，19种化合物保留时间稳定，峰型和分离度良好。方法的检出限在0.05~0.40 mg/L之间，回收率和精密度分别在61.65%~111.42%和1.02%~17.20%之间。在此基础上，应用该方法对不同品种分不同部位的紫苏进行了检测。19种化合物在不同紫苏部位中的含量差异极大，其中咖啡酸、迷迭香酸、木犀草素-7-O-二葡萄糖苷、芹菜素-7-O-二葡萄糖苷、野黄芩苷、芹菜素-7-O-葡萄糖苷和芹菜素等含量较大，在12个样品中均有检出，含量在0.05~24.05 mg/g之间。28#紫苏壳中共检出11种物质，含量在0.08~0.57 mg/g之间；紫苏壳和杆中均有木犀草素检出，含量在0.05~0.18 mg/g之间；紫苏叶中化合物含量顺序为迷迭香酸＞野黄芩苷＞芹菜素-7-O-葡萄糖苷。此外，本实验在紫苏壳中检出HMF和糠醛两种呋喃环衍生物。