miR-944在HPV16阳性宫颈癌患者组织表达及临床意义

郭 凤，黄 伟，王佩红，赵 莉

(汉中市中心医院1.妇科；2.神经外科，陕西 汉中 723000)

宫颈癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，仅在美国，每年就有大约13 000例新诊断宫颈癌[1]。中国宫颈癌的发病率远高于美国或其他发达国家，并且很多妇女初次诊断就已是宫颈癌晚期，严重影响患者的治疗效果及预后[2]。人乳头瘤病毒(human papilloma virus，HPV)16、HPV18感染是宫颈癌发生的主要原因之一[3]。微小RNA(microRNA，miRNA)是一类20～22nt、非编码的RNA，其通过完全或不完全碱基互补结合靶基因mRNA 的3′非编码区(3′ UTR)，从转录水平或转录后水平调控靶基因表达，进而影响各项生命活动[4]。研究表明，miRNA可以作为致癌或肿瘤抑制因子广泛调节宫颈癌细胞的增殖、迁移或凋亡[5]。但是miRNA与高危型HPV相关宫颈癌的相互作用还需进一步的探讨；本研究旨在探索miR-944在HPV16阳性宫颈癌患者组织中的表达情况，及其对于宫颈癌的早期诊断价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2019年1月至2020年12月在汉中市中心医院就诊的宫颈癌患者113例作为实验组，其中HPV16阳性70例，HPV 16阴性43例；并将同期在我院进行良性肿瘤切除术的78例患者作为对照组。两组患者年龄、分娩史、绝经比例等差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。

实验组纳入标准：①术后病理诊断为宫颈癌；②术前检测HPV16呈阳性或阴性；③病理资料完整；④术前未接受放化疗且治疗前半年内未服用激素类药物。对照组纳入标准：①术前诊断HPV16为阴性；②良性疾病行子宫切除患者，排除宫颈病变。排除标准：①合并其他恶性肿瘤；②严重心肝肾功能不全者；③患有严重感染性疾病患者。参加本研究的所有患者及家属均签署知情同意书；本研究已通过我院伦理委员会批准同意。

1.2 HE染色

宫颈癌患者接受根治性子宫切除术+盆腔淋巴结清扫术获取肿瘤组织和癌旁组织；良性肿瘤患者行子宫全切术或宫颈活检。获取组织后，即置于液氮或-80℃冰箱保存。组织经10%福尔马林固定后，进行常规石蜡包埋并切片，切片厚度为4μm。石蜡切片经二甲苯脱蜡，并经无水乙醇、95%乙醇、80%乙醇和蒸馏水水化后，使用苏木素染色5～10min，1%盐酸乙醇分化5～10s，并使用1%氨水反蓝，伊红染色1～3min，脱水透明，干燥后加滴中性橡胶封固，镜检。

1.3 实时荧光定量PCR检测miR-944组织表达情况

将组织标本采用液氮研磨，并采用TRIzol法提取组织总RNA，并通过Nanodrop 2000及琼脂糖凝胶电泳鉴定RNA的浓度和纯度，A260/A280处于1.8～2.1时可进行后续实验；取1μg总RNA反转录为cDNA；实时荧光定量PCR(real time fluorescent quantitative PCR，qRT-PCR)检测miR-944表达，严格按照SYBR Green PCR试剂盒操作。引物序列为：miR-944上游引物：5′-CGCGAGCAGGAAATTATTGTA-3′，下游引物：5′-TATGCTTGTTCTCGTCTCTGTGTC-3′；内参为U6，上游引物：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物：5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′，所有引物由上海生工合成。扩增程序为：95℃预变性5min，95℃变性15s，60℃退火30s，72℃延伸30s，进行40个循环，每个实验设置5个复孔，反应结束后采用2-ΔΔCt计算miR-944的相对表达量。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 两组患者病理切片对比

两组患者的组织切片进行HE染色后，对照组未见上皮细胞恶性病变组织，宫颈组织上皮层均为分化成熟的上皮细胞，细胞胞浆丰富，且上皮层未见挖空细胞，无核分裂现象。实验组宫颈癌组织显示上皮大部分细胞异型性明显，有挖空细胞，基底细胞非典型性，成熟结构紊乱，核分裂现象明显，见图1。

注：A.对照组；B.实验组。

2.2 两组患者miR-944表达差异

miR-944在实验组HPV16阳性患者的相对表达量为2.55±0.34；在实验组HPV16阴性患者中的相对表达量为1.88±0.43，在对照组中的相对表达量为1.38±0.41，miR-944表达在实验组HPV16阳性患者、实验组HPV16阴性患者及对照组之间差异有统计学意义(F=189.516，P<0.05)。两两比较显示，实验组患者miR-944的相对表达量明显高于对照组(P<0.05)；实验组中HPV16阳性患者 miR-944的相对表达量显著高于HPV16阴性患者(P<0.05)。见图2。

图2 不同患者miR-944的表达差异Fig.2 Differences in expression of miR-944 in different groups of patients

2.3 宫颈癌组织与癌旁组织miR-944表达差异

比较实验组患者肿瘤组织与癌旁组织miR-944表达差异，结果见图3。肿瘤组织miR-944的相对表达量为2.26±0.46，明显高于癌旁组织的1.32±0.39，差异有统计学意义(t=17.392，P<0.05)。

图3 宫颈癌患者肿瘤组织与癌旁组织miR-944的相对表达量Fig.3 Relative expressions of miR-944 in the cancer tissues and the adjacent tissues

2.4 ROC曲线评估miR-944对宫颈癌的诊断价值

ROC曲线评估miR-944对宫颈癌的诊断价值，结果见图4。ROC曲线下面积AUC为0.855，95%CI为0.790～0.921，敏感度为71.40%，特异度为97.30%，Youden指数为0.688，截断值为1.54。

图4 miR-944对宫颈癌诊断的ROC曲线Fig.4 ROC curve of miR-944 for diagnosing cervical cancer

2.5 miR-944与宫颈癌患者临床病理参数相关性

按照miR-944相对表达量的中位数(2.24)将实验组又分为miR-944低表达组(n=55)和miR-944高表达组(n=58)。分析miR-944与实验组患者临床病理学参数的相关性，结果显示miR-944与年龄、肿瘤大小无明显关系(P>0.05)；与HPV16感染、组织分化程度、FIGO分期、淋巴结转移明显相关(P<0.05)，见表1。

表1 miR-944与宫颈癌患者临床病理参数相关性[n(%)]Table 1 Correlations of miR-944 with clinicopathological parameters of the patients with cervical cancer [n(%)]

3 讨论

3.1 HPV16阳性与宫颈癌发生的相关性

HPV与高级别宫颈上皮内瘤变(cervical intraepithelial neoplasia，CIN)和宫颈癌的发生密切相关，研究发现40%～80%的宫颈癌患者属于单一HPV类型。HPV根据生物学特性分为高危型和低危型，其中高危型的E6和E7基因是宫颈癌发生的重要因子，E6通过泛素化水解途径降解转录因子p53，E7可介导肿瘤抑制因子pRB的降解；进而促进宫颈癌的发生[6]。Tao等[7]人调查了上海人群所有类型宫颈癌细胞学标本中个体高危型人乳头瘤病毒(HR-HPV)的患病率和致癌风险，发现HPV16/18在高级别的宫颈病变和鳞状细胞癌细胞学中分别有53.6%和66.7%的表达，由此可见，HPV16在宫颈癌变中是最常见的HPV亚型，需要引起临床工作者重视。

3.2 MiR-944在恶性肿瘤中的作用机制

MiRNAs参与调节多种生理活动，并且miRNAs在多种肿瘤组织中呈异常表达，作为调控基因影响肿瘤进展，也可作为癌症的诊断和预后的预测标志物。已有多个研究表明miR-944在不同肿瘤的发生发展中有重要作用，Tang等[8]人在大肠癌患者的临床试验中发现miR-944可以作为肿瘤抑制因子而抑制大肠癌的发现，其发现大肠癌组织中，miR-944表达下调，并且miR-944表达与原发肿瘤、淋巴结转移、远端转移及TNM(tumor node metastasis )分期、浸润程度呈明显负相关。双荧光素酶报告子分析表明，miR-944在结构上与GATA结合蛋白6(GATA6)结合，并与CRC细胞中的下游蛋白(CRT和p-AKT)相互作用而抑制大肠癌细胞的生物学行为。Jiang等[9]人也发现胶质瘤干细胞(GSCs)外泌体miR-944通过抑制VEGFC的表达和AKT/ERK信号通路来抑制胶质瘤的生长、进展和血管生成。通过以上结果表明，miR-944在不同类型的肿瘤中发挥不同的作用。

3.3 MiR-944在宫颈癌中的研究进展

MiR-944在宫颈癌进展中的作用也有所研究，李新菊等[10]人发现miR-944在宫颈癌细胞和组织中表达升高，并且能通过靶向调控S100PBP基因促进宫颈癌细胞增殖和迁移。本研究也有相似的结果，与对照组相比，实验组的宫颈癌组织miR-944表达显著升高，并且HPV16阳性患者miR-944表达显著高于HPV16阴性。采用ROC曲线评估miR-944的诊断价值，结果显示AUC为0.855，95%CI为0.790～0.921，敏感度为71.4%，特异度为97.3%；miR-944与年龄、肿瘤大小无明显关系(P>0.05)；与HPV16感染、组织分化程度、FIGO分期、淋巴结转移明显有关(P<0.05)。所以miR-944在宫颈癌的临床诊断中有重要作用，并且与病理学参数关系密切，可为临床医生制定治疗方案提供新思路。

综上，miR-944在HPV16相关的宫颈癌组织中差异表达，并且对于宫颈癌的早期诊断具有重要价值，也可作为治疗的潜在靶点；后期的研究中可通过体内体外实验进一步探究其在宫颈癌发生发展中的分子机制。