肝郁气滞、肝郁脾虚证慢性应激模型大鼠外周血Th17/Treg平衡偏移的比较❋

张 怡，张铭珈，冯庭宇，朱艳芳，敖海清

(广州中医药大学，广州 510000)

抑郁症是一类以持续性情绪低落，认知、思维活动迟缓、活动能力减退为主要特征的心境障碍[1]。在中医范畴，肝郁气滞和肝郁脾虚是抑郁症中最为常见的两个证型[2-3]。慢性心理应激会引起机体免疫功能的变化，赵荣华等[4]发现肝郁气滞、肝郁脾虚证型大鼠的免疫功能调控有差异。Th17/Treg细胞是机体免疫平衡调节的一组重要细胞对，已有研究发现慢性心理应激会引起机体Th17/Treg细胞偏移[5]，但对具体中医证型的研究尚未见报道。本实验观察比较了肝郁气滞证和肝郁脾虚证慢性应激大鼠外周血Th17/Treg细胞平衡偏移的异同，以探究慢性应激模型大鼠中这两种证型的免疫调节机制。本研究已通过广州中医药大学动物实验中心伦理委员会审查，编号20200908001。

1 材料

1.1 动物

SPF级SD雄性健康大鼠40只，体质量180～220 g，广州中医药大学实验动物中心提供,动物许可证号:SCXK(粤)2013-0034,分笼饲养于广州中医药大学SPF级动物实验室，饲养温度22 ℃，湿度50%～70%，光照时间12 h/d。

1.2 试剂

白细胞介素(interleukin,IL)-17A、IL-10、IL-6、转化生长因子(transforming growth factor,TGF)-βElisa试剂盒，货号分别为MM-70049R2、MM-0195R2、MM-0163M2、MM-45041M2，购自上海酶免公司；APC Anti-rat CD3(货号：557030)、FITC Anti-rat CD4(货号：561834)、BV421 Anti-rat CD25(货号：565608)、Anti-rat CD32(货号：550270)，购自美国BD公司；PE Anti-rat FOXP3(货号：12-5773-82)、PE-Cyanine7 Anti-rat IL-17A(货号：25-7177-82)，购自美国赛默飞公司。

1.3 主要仪器

DigBehv行为学检测系统，上海吉量科技有限公司；PE EnSpire多功能酶标仪，上海珀金埃尔默公司；FACSCelesta流式细胞仪，美国BD公司。

2 方法

2.1 动物模型建立

适应性饲养1周后，将40只SD大鼠随机分为空白组、肝郁气滞组、肝郁脾虚组、脾虚组，每组10只，造模方法参照文献[6-7]。肝郁气滞模型建立：将大鼠置于长22 cm，直径6.5 cm的自制圆柱形透气束缚瓶内，每天束缚6 h。肝郁脾虚模型建立：每天上午将大鼠束缚6 h，下午置于装满水，高50 cm、直径30 cm的桶里强迫游泳10 min,并隔天饮食。脾虚模型建立：每天强迫游10 min,隔天饮食。空白组在其他组进行束缚时禁食禁水，其余时间自由饮食。造模共计35 d。

2.2 检测指标与方法

2.2.1 体质量测定和一般体征观察 造模开始后，于第0，14，21，35天记录各组大鼠体质量变化。参照动物外观行为量表作为建模成功标准，每天观察各组大鼠的毛发、口唇色泽，大便的形状、修饰行为、精神状态等的变化情况[7]。

2.2.2 糖水偏好实验 参考文献先进行糖水训练，即第1天每个鼠笼放2瓶1%浓度的蔗糖水，第2天换成1瓶糖水和1瓶纯水[8]。第3天禁食禁水23 h，第4天同时放1瓶纯水和1瓶糖水，1 h后测算糖水消耗量。分别在造模前、造模第18天、造模第35天进行测量。糖水偏好率=(糖水消耗量/糖水消耗量+纯水消耗量)×100%

2.2.3 旷场实验 于造模第35天进行旷场实验[9]。使用80 cm×80 cm×40 cm旷场箱，内壁及底面均为黑色，摄像头安置在旷场箱的正上方。将大鼠置于中央区，每只大鼠观察5 min自由活动情况，统计指标为总路程、平均速度、中央路程。

2.2.4 取材 行为学实验结束后第2天取材。用2%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉各组大鼠，普通采血管和抗凝采血管经腹主动脉分别取血5 mL和3 mL，后脱颈处死大鼠，剥离脾脏和胸腺。脾脏指数=脾脏质量(mg)/体质量(g)，胸腺指数=胸腺质量(mg)/体质量(g)。

2.2.5 血清IL-17A、IL-6、TGF-β、IL-10、IL-23含量检测 普通管采集的非抗凝血液分装上层血清后，使用Elisa试剂盒严格按照说明书进行操作，检测各组大鼠血清中IL-17A、IL-6、TGF-β、IL-10、IL-23水平。

2.2.6 外周血Th17、Treg细胞检测 取3 mL新鲜抗凝血液,采用密度梯度离心法分离出外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)，加入含10%FBS和1%双抗的RPMI 1640培养液,稀释细胞至2×106个/mL,取细胞液接种在12孔板上，37 ℃，5%CO2培养5 h。Th17细胞检测：收集细胞，加入流式管内，加入FITC标记的CD4单克隆抗体，避光孵育20 min。PBS清洗2次，加入固定/破膜液，避光孵育20 min，PBS清洗2遍，加入IL-17A-PE抗体2 μL,避光孵育30 min,PBS清洗2次，进行流式细胞检测。Treg细胞检测：按照上述方法收集细胞，加入FITC标记的CD4、BV 421标记的CD25抗体进行胞外因子染色，透膜/固定30 min后，进行FOXP3抗体染色，避光孵育30 min后上机检测。

2.3 统计学方法

3 结果

3.1 大鼠体质量和一般表征观察结果

如图1所示，造模期间大鼠体质量随着时间的增长而增加，与空白组大鼠比较，肝郁气滞组、肝郁脾虚组、脾虚组大鼠体质量增长明显变慢(P<0.05)。肝郁气滞组大鼠造模3周后由易激怒、焦躁不安逐渐转为活动与修饰行为减少，饮食下降且毛发欠顺泽等表现；肝郁脾虚组大鼠从易激怒、焦躁不安逐渐转为反应迟钝、争斗减少、扎堆懒动、大便不成形、毛发脏乱、饮食下降等表现。脾虚组大鼠逐渐出现食量下降、唇色变淡、扎堆懒动、大便不成形等表现。

注：与空白组比较**P<0.01

3.2 糖水偏好结果

如表1所示，造模第18天及35天，肝郁气滞组和肝郁脾虚组大鼠的糖水偏好率较空白组显著下降(P<0.05)。

表1 各组大鼠造模期间糖水偏好率比较

3.3 旷场实验结果

如表2所示，造模第35天，肝郁气滞组和肝郁脾虚组大鼠旷场实验的总路程、平均速度及中央路程较空白组明显下降(P<0.05)。

表2 各组大鼠旷场实验结果

3.4 脾脏指数、胸腺指数结果

如表3所示，与空白组比较，肝郁气滞组和脾虚组大鼠脾脏指数显著降低(P<0.01,P<0.05)；各组大鼠胸腺指数差异无统计学意义(P>0.05)。

表3 各组大鼠脾脏指数与胸腺指数比较

3.5 血清IL-17A、IL-6、TGF-β、IL-10检测结果

如表4所示，在Th17相关细胞因子中，肝郁气滞组大鼠外周血清IL-17A、IL-6含量较空白组显著下降(P<0.01)，肝郁脾虚组大鼠的IL-17A含量较空白组下降(P<0.05)，较肝郁气滞组上升(P<0.05)；在Treg相关的细胞因子中，肝郁气滞组和肝郁脾虚组外周血清的IL-10含量较空白组明显下降(P<0.01)，肝郁脾虚组的TGF-β含量较空白组显著下降(P<0.01)。与空白组比较，肝郁气滞组的IL-17A/IL-10的比值下降(P<0.01)，肝郁脾虚组IL-17A/IL-10的比值差异无统计学意义(P>0.05)。

表4 各组大鼠血清相关细胞因子检测结果

3.6 外周血Th17、Treg细胞在CD4+T细胞中的占比结果

如图2和图3所示，与空白组比较，肝郁气滞组和肝郁脾虚组大鼠外周血中Treg细胞占比明显下降(P<0.01，P<0.05)，肝郁气滞组大鼠外周血Th17细胞占比显著降低(P<0.01)。与空白组比较，肝郁气滞组大鼠外周血Th17/Treg的比值明显下降(P<0.05)，肝郁脾虚组差异无统计学意义(P>0.05)。

图2 Th17和Treg细胞占CD4+T细胞的比例流式图

注：与空白组比较*P<0.05，**P<0.01；与肝郁气滞组比较△P<0.05

4 讨论

中医学将抑郁症归为“郁病”范畴，其主要累及肝、心、脾三脏。《丹溪心法》有“郁者,结聚而不得发越也”，认为肝气郁结是抑郁症的主要病机[10]。《金匮要略》云“夫治未病者,见肝之病,知肝传脾,当先实脾”,肝木乘脾，易致脾虚，肝郁脾虚亦是抑郁症的主要证型之一。肝郁气滞证和肝郁脾虚证是抑郁症中最常见的两个证型[2-3,11]。肝主疏泄，调畅气机，脾主运化，参与卫气的生成，对机体防御功能起到重要作用[12-13]，而肝郁气滞、肝郁脾虚证型慢性应激大鼠的免疫功能调控有差异[4]。本文通过束缚、束缚+力竭游泳+饮食失节分别建立肝郁气滞和肝郁脾虚证慢性应激大鼠模型，进一步探讨其免疫功能的变化机制。

Th17和Treg细胞是CD4+T细胞中的两类亚群，是一组免疫平衡调节细胞对，Th17细胞通过特异性转录因子维甲酸相关核孤儿受体γt(retinoid-related orphan nuclear receptorγt,ROR-γt)调控分泌IL-17、IL-6等促炎性细胞因子，参与免疫激活与炎症反应。Treg细胞的特异性转录因子叉头框蛋白3(forkhead box protein 3,Foxp3)可促进Treg分泌IL-10、TGF-β等免疫抑制因子，抑制Th17细胞分化、抑制免疫激活。二者相互拮抗，共同维持机体免疫调节的平衡[14]。研究发现慢性应激可引起机体Th17/Treg细胞偏移[5]。本研究通过检测了Th17、Treg相关指标，从Th17/Treg的平衡角度来探讨肝郁气滞和肝郁脾虚抑郁症大鼠模型的免疫调节机制。结果显示，肝郁气滞组和肝郁脾虚组大鼠外周血中Th17、Treg细胞占比较空白组都有所降低，肝郁气滞组Th17细胞的占比较肝郁脾虚组明显下降。大鼠外周血清中，肝郁气滞组的Th17相关细胞因子IL-17A、IL-6表达较空白组降低，肝郁脾虚组的IL-17A的表达较空白组下降；Treg细胞相关细胞因子IL-10在肝郁气滞组和肝郁脾虚组中较空白组显著降低；Th17与Treg的比值可代表免疫偏移的方向，与空白组比较，肝郁气滞组的比值显著下降，提示肝郁气滞组向免疫抑制方向偏移，IL-17A与IL-10的比值也指向肝郁气滞组出现了免疫偏移，其余组与空白组比较差异均无统计学意义，由此可推测肝郁气滞组是通过调节Th17细胞及其相关炎症因子的表达导致免疫失衡的。

综上所述，肝郁气滞证与肝郁脾虚证慢性应激模型大鼠的机体免疫功能都有所下降，肝郁气滞证模型大鼠的免疫功能倾向于Th17/Treg细胞偏移引起的免疫抑制，肝郁脾虚证模型大鼠的免疫功能下降与Th17/Treg平衡偏移无关。