DDIT3 免疫组织化学检测在黏液样脂肪肉瘤诊断中的意义

孟丽，步鹏，雷颖，赵国海，靳佩玉，徐恩伟

（1 山西医科大学基础医学院，太原030000；2 山西省肿瘤医院·中国医学科学院肿瘤医院山西医院·山西医科大学附属肿瘤医院病理科，太原 030013）

脂肪肉瘤是来源于原始间叶组织的恶性肿瘤，是成人最常见的软组织肿瘤，占软组织肉瘤的25%～30%。脂肪肉瘤有不同亚型，包括高分化脂肪肉瘤、去分化脂肪肉瘤、黏液样/圆细胞脂肪肉瘤、多形性脂肪肉瘤、黏液样多形性脂肪肉瘤[1]，其中黏液样脂肪肉瘤（myxoid liposarcoma, MLP）占所有脂肪肉瘤的25%～50%[2]。仅靠形态学无法准确区分各个脂肪肉瘤亚型，并且有些MLP 组织内有圆形细胞区，当圆形细胞占细胞总数的5%以上[3]，称为高级别MLP，部分高级别MLP 以圆形细胞成分为主时，其难以与其他圆细胞肿瘤区分，纯黏液样脂肪肉瘤代表肿瘤中高分化成分，圆细胞脂肪肉瘤代表肿瘤中低分化的成分，两者的遗传学改变相同。95%的MLP 存在FUS‐DDIT3 融合基因，相较于通过荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization, FISH）鉴定DNA损伤诱导转录因子3（DNA‐damage inducible transcription3, DDIT3）重排，或通过实时荧光聚合酶链反应检测融合转录体，免疫组织化学方法更加便捷，快速和廉价。本研究旨在评估DDIT3 免疫组织化学检测诊断MLP 的可靠性，及其在MLP 鉴别诊断中的意义。

材料与方法

1 材料

收集山西省肿瘤医院病理科2014 至2021 年经FISH 检测确诊的MLP（手术前未接受过放化疗等与肿瘤相关的治疗）存档蜡块42 例，其中20 例为高级别；男性29 例，女性13 例，年龄22 ～90 岁，平均年龄51±13 岁。肿瘤发生部位以大腿多见，共29 例（70%）；其次为小腿和腹股沟，分别为4 例和2 例；其他7 例分别位于上臂、肩背部、腰部等部位。另外选取其他圆细胞肿瘤及高分化脂肪肉瘤蜡块73 例作为对照，包括20 例高分化脂肪肉瘤伴间质黏液变性、13 例横纹肌肉瘤（包括腺泡状横纹肌肉瘤和胚胎性横纹肌肉瘤）、10 例尤文肉瘤、10例滑膜肉瘤、10 例间叶性软骨肉瘤、10 例促结缔组织增生性小圆细胞肿瘤。研究遵循的程序经伦理委员会批准，伦理审批编号：202237。

2 方法

所有标本均由10%中性福尔马林固定，石蜡包埋，重新进行切片和常规HE 染色，由2 名病理科医师重新阅片以明确诊断。用于免疫组织化学染色的石蜡组织切片厚度均为3 µm，应用罗氏公司Bench‐MarkXT 全自动免疫组织化学染色仪进行Envision法免疫组织化学染色，兔抗DDIT3（phospho S30）第一抗体（美国Abcam 公司）稀释度为1 ∶100，第二抗体为辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG（罗氏上海诊断产品有限公司），工作浓度为40 μg/mL。免疫组织化学染色后苏木素复染，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片而后光镜下阅片。

3 结果判读

DDIT3 阳性定位于细胞核，以细胞核出现棕黄色颗粒为阳性。根据阳性肿瘤细胞的百分比评分：＜5%为0 分、6%～50%为1 分、51%～70%为2分、＞71%为3 分；染色强度评分：强阳性为3 分、中等强度阳性为2 分、弱阳性为1 分、阴性为0 分。以阳性百分比与染色强度评分的乘积定义DDIT3 在MLP 中的表达情况，≥2 分为高表达，1 分为低表达，0 分为阴性。

4 统计学处理

使用SPSS25.0 软件对数据进行统计学分析。两独立样本间的比较采用Wilcoxon符号秩检验；相关性分析采用Pearson 卡方检验，当理论数小于5 时，采用Fisher 确切检验。P＜0.05 为差异具有统计学意义。

结 果

大体标本上，以黏液为主的MLP 表现为多结节状，切面呈胶冻样，通常无坏死；以圆形细胞为主的区域表现为不透明灰白色结节、鱼肉样外观。HE染色显微镜下观察显示，低级别区域肿瘤呈多结节状生长，结节之间可见纤维性间隔，结节内细胞密度不等，通常肿瘤周边显示细胞较丰富；肿瘤细胞由形态较一致的原始间叶细胞（图1C）与印戒样脂肪母细胞（图1C）混合构成，间质有丰富的黏液，可见多量树枝状毛细血管网（图1A）；部分病例黏液样基质可形成黏液湖，形成肺水肿样形态学表现（图1B）。肿瘤细胞罕见坏死及核分裂像。高级别MLP 细胞密度明显增加，呈实性片状分布，可见数量不等的脂肪母细胞，低倍镜下呈“小蓝圆”细胞成片聚集（图1D）。

图1 MLP 组织病理学特征（HE 染色）。A，黏液背景下毛细血管网呈树枝状，星号示黏液背景，箭头示树枝状毛细血管；B，肺水肿样结构；C，MLP 由形态较一致的原始间叶细胞与印戒样脂肪母细胞混合构成，黑箭示印戒样脂母细胞；白箭示原始间叶细胞；D，高级别MLP，白箭示成片聚集的“小蓝圆”细胞。比例尺：A，40 µm；B，125 µm；C，20 µm；D，20 µmFig.1 The histopathological features of MLP (HE staining). A, branching capillary network in a mucoid background, * indicating mucoid background,and arrowhead showing branching capillaries; B, pulmonary edema‐like pattern; C, MLP composed of uniform primitive mesenchymal cells and signet ring‐like lipoblasts, black arrow indicating signet ring‐like lipoblasts, and white arrow showing primitive mesenchymal cells; D, high‐grade MLP, white arrows indicating clusters of “small blue round” cells. Scale bars: A, 40 µm; B, 125 µm; C, 20 µm; D, 20 µm

免疫组织化学检测显示，42 例MLP 病例中DDIT3 阳性表达率为100%，高表达率为83.3%（35/42），其中35 例高表达，呈弥漫性中等至强染色；7 例低表达（图2）；部分MLP 低表达的原因可能由于蜡块保存时间过久或保存不当，而失去了部分抗原性。在圆细胞肿瘤对照组中，DDIT3 高表达率为5.7%（3/53），有2 例滑膜肉瘤、1 例尤文肉瘤DDIT3 高表达，其余病例肿瘤细胞染色强度均低于实验组，染色强度只有1 分，且染色不均匀，呈局灶阳性或者阴性（图3）。DDIT3 在MLP 中的表达水平明显高于圆细胞肿瘤组（表1），表明DDIT3 免疫组织化学检测对于区分MLP 尤其是高级别MLP和其他圆细胞肿瘤具有重要意义，DDIT3 免疫组织化学检测对形态学评估是有益的补充。

表1 DDIT3 表达情况在MLP 和其他圆细胞肿瘤、高分化脂肪肉瘤中的关系Tab.1 Relationship between DDIT3 expression in myxoid liposarcoma and other round cell tumors,well-differentiated liposarcoma

图2 黏液样脂肪肉瘤中DDIT3 表达的免疫组织化学检测（苏木精复染）。A，高表达；B，低表达；比例尺，20 µmFig.2 Immunohistochemical examination for DDIT3 exoression in myxoid liposarcoma (counterstaining with hematoxylin). A, high expression; B, low expression; scale bar, 20 µm

此外，在20 例高分化脂肪肉瘤伴黏液变性病例中，有13 例呈高表达，7 例呈低表达（图4），DDIT3 在MLP 与高分化脂肪肉瘤伴黏液变性组的表达水平差异无统计学意义（表1），提示DDIT3免疫组织化学检测对于MLP 与高分化脂肪肉瘤伴黏液变性的鉴别诊断的价值有限，需谨慎解读免疫组织化学染色 结果。

讨 论

MLP 是儿童、青少年常见的脂肪肉瘤亚型，常发生在下肢深部软组织，可发生腹腔和骨转移[4]。由于圆细胞脂肪肉瘤与黏液样脂肪肉瘤具有相同的分子遗传学改变，2013 年WHO 分类中取消了圆细胞脂肪肉瘤的亚型，将其视为一种高级别的黏液样脂肪肉瘤。形态学上，MLP 典型表现是黏液样基质背景分布有均匀的梭形或卵圆形原始间叶细胞，并伴有特征性的树枝状毛细血管网络，以及有印戒样脂母细胞[5]的聚集，部分病例可见原始间叶细胞呈肺水肿样结构排列[6]。高级别MLP 罕见脂母细胞，瘤细胞呈圆形，低倍镜下呈“小蓝圆”细胞聚集，黏液样基质不明显，易被误诊为其他圆细胞肿瘤，圆细胞成分与转移风险增加及预后不良相关。

DNA 损伤诱导转录因子3（DDIT3）又称为GADD153、CHOP、C/EBPζ，是转录因子C/EBP 家族中的一个成员[7]。DDIT3 是一种核定位的DNA 转录因子，位于12 号染色体q13.2 区，在诱导细胞周期阻滞、促进细胞分化和凋亡等方面发挥着重要作用[8]，该蛋白的表达与脂肪和造血细胞[7]的增殖、分化有关。正常FET 基因（FUS、EWSR1、TAF15）编码RNA 结合蛋白，参与多种过程，包括转录调控、剪接、RNA 运输和DNA 修复[9]。在大多数MLP 中，发生t（12；16）（q13；p11）易位[10]，导致FUS 的N 末端活性结构域和DDIT3 整个编码序列融合，形成嵌合癌蛋白FUS‐DDIT3[6]，这种嵌合癌蛋白可以通过作用于参与脂肪形成早期和晚期的转录因子来阻止脂肪细胞前体分化，阻止正常脂肪生成[11]，从而导致肿瘤的发生，FUS–DDIT3 的两个基因相互作用，影响融合蛋白的稳定性和表达水平，约95%的MLP 都存在FUS‐DDIT3 融合癌基因。FUS‐DDIT3通过调节miR‐486/CDK4 轴来调节脂肪肉瘤细胞的增殖和凋亡[12]，同时通过激活SRC/FAK/RHO/ROCK信号轴增加其侵袭潜能[13]，这些信号通路成为治疗MLP 的重要靶点。此外，在少数MLP 病例中，存在t（12；22）（q13；q12）易位[10]，形成嵌合癌蛋白EWSR1‐DDIT3。

临床工作中，大多数融合基因通过FISH 或RT‐PCR 的方法来鉴定，使用DDIT3 分离探针检测脂肪肉瘤中是否存在DDIT3 重排是诊断MLP 的一种敏感性和特异性均较高的方法。但这些方法一次只能检测一种先前鉴定的已知的基因融合亚型，费用相对较高，且对实验室要求较高，FISH 检测结果的判读需要对病理医师进行专门的培训，不利于基层医院开展；二代测序能对多个基因进行测序，具有额外的优势[14]，可准确鉴定对诊断有高度特异性的所有基因融合，但其成本较高并且报告周期较长。因此，临床工作中急需一种简便、快速、可靠的方法应用于脂肪肉瘤的诊断与鉴别诊断，之前IHC 用于MLP 的诊断一直缺乏特异性较高的抗体，最近的一项研究阐述了一种新的DDIT3 抗体在区分MLP 与其他黏液样软组织肿瘤中的作用[15]，免疫组织化学检测较传统的FISH 或PCR 检测而言，可提供一种更加快速、廉价且易于推广的诊断和鉴别诊断方法，帮助无基因检测条件的基层医院对脂肪肉瘤进行初步诊断，DDIT3 表达的检测和分析有望与形态学和现有的分子病理检测互补。

由纯圆形细胞构成的高级别MLP，单纯依靠形态学很难与其他圆细胞肿瘤区分开来。本研究结果显示MLP 的DDIT3 蛋白表达水平显著高于其他圆细胞肿瘤，可以鉴别黏液样/圆细胞脂肪肉瘤和其他圆细胞肿瘤。使用DDIT3 抗体对肿瘤进行免疫组织化学检测，同时结合组织学观察形态学特征，病理医生能够对MLP 做出初步的诊断。此外，DDIT3 免疫组织化学检测也可以提供一种简便的方法来评估MLP 的手术切缘是否受累。因此，DDIT3 免疫组织化学可以补充单纯的形态学评估以及现有的辅助诊断技术，有助于MLP 的病理诊断。

病理医生在鉴别黏液样脂肪肉瘤与高分化脂肪肉瘤时，通常依据形态学表现选用不同的FISH 探针进行检测。对于高分化脂肪肉瘤，MDM2/CEP12 双色荧光探针检测可发现MDM2 基因扩增；而DDIT3双色分离探针检测DDIT3 基因重排阳性可证实黏液样脂肪肉瘤的诊断。然而在部分高分化脂肪肉瘤的病例中存在广泛的间质黏液变性，这可能导致病理医生在鉴别诊断时选用FISH 探针时出现偏差。我们试图通过DDIT3 免疫组化检测在FISH 检测前进行探针选择的初步筛选。然而本研究结果显示高分化脂肪肉瘤组与实验组DDIT3 表达水平的差异无统计学意义，这可能由于高分化脂肪肉瘤的基因特征是MDM2 基因扩增，MDM2 基因位于12 号染色体q15 区；DDIT3 基因位于12 号染色体q13.2 区，与MDM2 的位置非常接近，由于这种位置上的接近性，DDIT3 基因可以在部分高分化脂肪肉瘤病例中发生扩增[16]，DDIT3 基因扩增可能可以解释部分高分化脂肪肉瘤中存在间质黏液变性，形成MLP 的形态特征[17]。一项研究中表明，在去分化脂肪肉瘤中检测到DDIT3 及STAT6 蛋白的低表达，表达率分别为16%、14%，两者表达率相似。去分化脂肪肉瘤的基因特征与高分化脂肪肉瘤相同，亦为MDM2 基因的扩增，STAT6 基因位于12 号染色体q13 区，STAT6和DDIT3 基因在染色体上相邻，两者均与MDM2 基因位置非常接近，这证明DDIT3 蛋白表达的变异性可能与其基因的位置有关[15]。本研究结果显示在间质黏液变性的高分化脂肪肉瘤中DDIT3 蛋白表达水平较高，可能是由于DDIT3 与MDM2 基因位置彼此相邻，MDM2 基因扩增导致DDIT3 蛋白非特异性表达。因此，DDIT3 免疫组织化学检测尚不能很好鉴别黏液样脂肪肉瘤与伴有黏液变性的高分化脂肪肉瘤。二者的鉴别诊断仍需使用FISH 或RT‐PCR 的方法。

总之，本研究中所有的MLP 病例DDIT3 呈阳性表达，在其他圆细胞肿瘤中，DDIT3 仅显示了有限表达，这对于鉴别MLP 尤其是高级别MLP 和其他圆细胞肿瘤具有重要意义。DDIT3 免疫组织化学检测对形态学评估是有益的补充，可作为MLP 诊断和鉴别诊断的辅助方法。此外，相对于FISH、PCR 或NGS 检测而言，IHC 检测以一种更加便捷、容易推广的方式帮助病理医师对于MLP病理诊断的评估。然而，本研究结果显示DDIT3 免疫组织化学检测对于黏液样脂肪肉瘤与高分化脂肪肉瘤伴黏液变性的鉴别诊断的价值有限，二者之间的鉴别尚需基因检测进一步明确。本研究不足之处在于纳入实验的病例仍然有限，未把其他亚型的高分化脂肪肉瘤或去分化脂肪肉瘤纳入其中，因此，使用DDIT3 抗体检测脂肪肉瘤不同亚型之间的鉴别诊断价值还有待进一步的研究，在临床实践中，DDIT3 免疫组织化学的结果应综合形态学以及临床特征谨慎分析。对于MLP 的病理学诊断，DDIT3 免疫组织化学检测取代传统分子学检测，还需要更多的确认性研究。