桦木酸抗纤维化作用及其机制研究进展

令狐飞飞 综述 赵勇 审校

遵义医科大学第一附属医院呼吸与危重症科，贵州 遵义 563000

桦木酸(betulinic acid，BA)属于羽扇豆烷型五环三萜类物质，别称白桦酸、桦脂酸[1-2]。在早期，学者发现BA可以抑制淋巴细胞中HIV的复制[3-4]，随后相继发现桦木酸有着多种较强的生物活性，如抗氧化应激、抗炎、抗肿瘤、免疫调节、抗菌、抗溃疡、抗疟疾等[5-8]。纤维化通常被认为是多种刺激因素诱导慢性炎症反应的最终结果，主要特征表现为细胞外基质(etracellular matrix，ECM)调节异常、胶原过度沉积，最终导致组织结构破坏、功能丧失、器官衰竭，纤维化形成是多种器官组织慢性损伤后最常见的病理学改变[9-10]。常见的组织纤维化类型包括肺纤维化(如特发性肺纤维化)、心脏纤维化(如心肌病)、肝纤维化(如肝硬化)、肾纤维化(如慢性肾脏病)等。目前治疗纤维化疾病主要是通过抗炎，缺乏能够完全抑制或逆转纤维化的治疗手段，从而不能延缓进行性纤维化疾病快速恶化，常导致患者的生存期较短，如特发性肺纤维化，一旦确诊，中位生存期仅2～3年。过去纤维化一度被认为是不可逆的，但最近研究提出了器官纤维化可逆性概念，这为纤维化领域研究提供了新的方向。近来发现BA兼顾有抗纤维化作用，故本文对桦木酸抗纤维化作用及其机制进行简要综述，提供BA抗纤维化的研究方向及其进展，为开发新的抗纤维化疗法提供选择。

1 桦木酸抗纤维化的作用

1.1 桦木酸在肺纤维化模型中的作用 肺纤维化主要表现是肺组织瘢痕形成，过量的胶原沉积使肺泡壁增厚,导致换气功能障碍，最终可使患者呼吸衰竭缺氧窒息而死亡，5年生存率仅为30%～50%，致死率高于多种癌症且发病率呈逐年上升趋势[11]。美国食品药品管理局批准治疗特发性肺纤维化(IPF)药物包括吡啡尼酮和尼达尼布，二者均被认为可以延缓IPF发病进程，但是不能够逆转肺纤维化，且存在相关的副作用。BA表现出抗肺纤维化作用，国内外均有报道；李雅群等[12]通过浓度分别为2.5μg/mL、5μg/mL、10μg/mL的桑白皮提取物桦木酸干预TGF-β1诱导的上皮间质转化模型，结果证明BA能够抑制转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)诱导的人肺泡上皮细胞上皮间质转化。博来霉素(BLM)能够建立经典的IPF模型。有发现在BLM诱导小鼠肺纤维化的预防模型(造模7 d后给予BA干预)及治疗模型(造模14 d给予BA干预)证明低剂量(20 mg/kg)、中剂量(40 mg/kg)、高剂量桦木酸(80 mg/kg)干预后，BA能够改善小鼠肺纤维化、肺通气功能、动态顺应性、生存率、体质量下降等，以高剂量疗效显著，且BA组疗效优于吡非尼酮组。

1.2 桦木酸在心脏纤维化模型中的作用 心脏纤维化特点是心脏成纤维细胞(cardiac fibroblasts，CFs)的增殖和ECM在心肌间质中大量沉积，是各种心血管疾病包括心肌梗死、心肌肥厚和心力衰竭中心环节[13]。Jiang等[14]通过高糖体外诱导CFs活化，经BA干预后，结果显示BA预处理后能够显著抑制了高糖诱导的CFs增殖；RT-qPCR分析结果表明，BA预处理后能够抑制了高糖诱导的CFs中α-平滑肌动蛋白(α-smooth actin，α-SMA)mRNA的表达，Western blot与RT-qPCR分析结果一致。此外，也有发现桦木酸衍生物(BA5)通过诱导IL-10和M2极化减轻实验性慢性恰加斯病心肌病的炎症和纤维化。

1.3 桦木酸在肾脏纤维化模型中的作用 肾纤维化主要表现为ECM的过度积聚，正常组织被瘢痕组织取代，最终导致终末期肾功能衰竭，需要透析或肾移植才能生存[15]。Sharma等[16]经过研究证明BA对腺嘌呤诱导的慢性肾脏病(CKD)大鼠肾脏纤维化有保护作用，表现为BA(30 mg/kg)对CKD大鼠的血清尿素氮、肌酐和尿酸水平升高，肾脏损伤标志物如胱抑素C和中性粒细胞明胶酶相关脂蛋白水平升高，TGF-β、结缔组织生长因子(connective tissue growth factor，CTGF)、纤维连接蛋白(fibronectin，Fn)、Ⅰ型胶原(typeⅠcollagen，ColⅠ)和羟脯氨酸(hydroxyproline，HYP)等纤维化标志物水平升高有明显的逆转作用。核因子-κB(nuclear factor-κB，NF-κB)是有着多种功能的核转录因子，能够调控多种细胞因子、趋化因子以及黏附因子的基因转录，且大量研究证明NF-κB活性在抗炎及纤维化疾病的调节中起着重要作用，Wang等[17]证明白BA可以通过抑制NF-κB信号通路的激活减轻实验性糖尿病肾病模型的炎症和纤维化。

1.4 桦木酸在肝脏纤维化模型中的作用 许多炎性细胞因子和生长因子可激活肝星状细胞(hepatic stellate cells，HSCs)，然后活化的HSCs转化为增殖、纤维化、收缩的肌成纤维细胞，该细胞能够分泌大量的ECM并表达α-SMA，导致瘢痕组织的进行性积累，最终导致肝硬化和肝功能衰竭[18]。Wan等[19]通过硫代乙酰胺(TAA)建立大鼠肝纤维化模型后予BA(20或50 mg/kg)干预证实BA可以减轻TAA介导的肝组织Hyp和α-SMA的升高而防治肝纤维化；Wan发现在体外BA能促进分泌纤维化因子细胞的调亡而缓解肝纤维化。大量研究发现，BA能够缓解肝纤维化[20-22]；Mu等[23]还证实经150 mg/kg·d BA干预高脂饲料喂养的小鼠后BA可减轻小鼠脂肪酸合成、肝脏的纤维化和炎症，并促进脂肪酸氧化，同时BA在体内外对脂肪酸合成酶(FAS)的表达和活性均有明显的抑制作用。

1.5 桦木酸在肠纤维化模型中的作用 慢性、反复或未消退的肠炎会影响组织损伤和重建，使ECM过度沉积和正常组织功能丧失导致肠纤维化[24]。Prados等[25]研究发现白桦酸羟肟酸盐(betulinic acid hydroxamate，BAH)呈剂量依赖性地促进成纤维细胞胶原凝胶收缩；口服BAH[20，50 mg/(kg·d)]连续17 d可以预防小鼠结肠炎症和纤维化，表现为经BAH处理的小鼠结肠组织中纤维化标志物和炎性标志物显著降低，结肠上皮屏障的完整性和创面愈合明显改善。

2 桦木酸抗纤维化的作用机制

2.1 抗炎 炎症是常见的基本病理过程，调节炎症过程可以干预多种疾病的发生、发展。抗炎作用是桦木酸重要的生物活性之一[26]。纤维化是慢性炎症持续作用的结果，导致ECM过度沉积和正常组织功能的丧失。炎症细胞在纤维化疾病中发挥重要作用，多种炎症细胞可产生促纤维化因子如转化生长因子-β、血小板衍生长因子、成纤维化生长因子，其中转化生长因子-β可能是最重要的促纤维化因子[27]。BA可通过减轻炎症降低脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)诱导的急性肺水肿[28]。Prados等[25]通过研究发现BAH能够减轻三硝基苯磺酸和葡聚糖硫酸钠诱导肠病模型的炎症，包括克隆恩病和溃疡性结肠炎，通过PCR分析常见纤维化基因，BAH干预后能够减轻结肠的纤维化标记物(Tnc、Col1a2、Col3a1、Timp-1、α-SMA)以及炎症标记物(F4/80+、CD3+、Il-1β、Ccl3)表达，并且能够保护胃肠黏膜屏障，减少肠道血管数量及面积的增加。JIAN等[14]证明BA可通过抑制TGF-β1/Smad信号通路抑制高糖诱导的心脏成纤维细胞的ECM的表达。Sharma等[16]通过研究证实BA可通过下调TGF-β、CTGF、Fn、ColⅠ和Hyp等纤维化标记物水平的升高，从而对CKD大鼠模型起到肾脏保护和抗纤维化作用。

炎症刺激会激活相关信号通路如NF-κB通路，信号通路的活化又会导致细胞因子、黏附分子以及炎症级联效应等多种分子的基因表达，从而加重炎症反应，BA的抗纤维化作用可通过抑制NF-κB核蛋白转位介导。Wan在鼠肝硬化模型中给予BA干预后证实BA可以减轻Hyp和-αSMA的表达预防肝纤维化。Wan发现在体外BA能有效降低TNF-α诱导的HSC-T6细胞活力，且对正常人肝细胞毒性较低。基质金属蛋白酶能够降解ECM，而基质金属蛋白酶组织抑制剂能够抑制其活性，BA能够显著降低α-SMA和金属蛋白酶组织抑制因子-1(tissue inhibitor of metalloproteinase-1，TIMP-1)的表达，升高基质金属蛋白酶-13(matrix metalloproteinase-13，MMP-13)的水平，并且呈时间依赖性地抑制Toll样受体4(toll-likereceptor 4，TLR4)、髓系分化因子88(myeloid differentiation factor 88，MyD88)的表达和NF-κB的激活[19]。乙醇可以诱导HSCs活化，白桦脂醇和白桦酸抑制乙醇诱导的TNF-β、TGF-β1、TIMP-1 TIMP-2的产生，p38MAPK和JNK信号是一种能够分泌促炎细胞因子的信号蛋白，白桦脂醇可以抑制p38MAPK和JNK信号转导通路的激活，而白桦脂酸仅抑制JNK信号转导通路；TGF-β1能通过下游信号分子Smad2和Smad3调节胶原纤维基因的表达，白桦脂醇和白桦酸还能显著抑制TGF-β1和Smad3的磷酸化，减弱TGF-β1和NF-κB/IkB信号转导信号的激活，从而减少HSCs激活后纤维化标志物的表达(α-SMA和colla1)[21]。NF-κB是细胞内重要的转录因子，当抑制蛋白IκB与NF-κB形成复合物时，能够使NF-κB保留在细胞质中，从而抑制NF-κB下游基因的表达，如炎症及纤维化因子等。Wang等[17]发现20 mg/kg白桦酸可以抑制糖尿病大鼠IkBa的磷酸化，稳定NF-κB而抑制NF-κB的激活，从而抑制FN表达，减少细胞外基质的沉积，达到预防糖尿病大鼠肾纤维化的作用。另外，BA除了能够防治肝硬化之外，在非酒精性脂肪肝病(nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD)及脂肪肝炎(nonalcoholic steatohepatitis，NASH)中也表现出治疗作用。巨噬细胞来源的TGF-β1是已知的最有效的能激活肝星状细胞的纤维化激动剂，免疫组化结果显示，经浓度为150 mg/kg桦木酸治疗高脂饮食小鼠后CD68阳性库普弗细胞的数量明显减少，且BA逆转了高脂饮食诱导的TGF-β1的增加，同时BA治疗后各纤维化标志物的(co13α、α-SMA、CTGF)mRNA水平也有所改善。炎症和纤维化是NASH的特征，NASH是NAFLD的进展型，BA治疗可抑制肝组织炎症相关基因(TNF-α、IL-6、IL-1β)表达水平的升高[23]。有研究发现LPS引起的急性肺损伤中，通过25 mg/kg的BA口服后，肺部组织病理学检查可见炎症反应明显减轻，抑制一氧化氮合酶的增加，减轻NO释放过多带来的细胞毒性及炎症反应[28]，此外白桦酸和木酚酸(五环三萜类)也能显著减轻角叉菜胶引起的小鼠肺部炎症[29]。综上所诉，BA可以通过抑制炎症细胞、炎症因子、炎症信号通路实现抗纤维化作用，但是相关研究国内外仍较少，其通过抗炎治疗纤维化的机制目前尚未完全阐明，期待未来进一步研究。

2.2 抗氧化 活性氧(reactive oxygen species，ROS)具有重要的生理作用，当细胞内的ROS水平超过抗氧化能力时就会发生氧化应激，这种氧化还原失衡状态可能导致细胞大分子(如DNA、脂质和蛋白质)的损伤和(或)细胞因子的产生，最终可能导致器官功能障碍，越来越多的证据支持过量的ROS与许多慢性疾病(包括纤维化疾病)之间存在联系[30]。研究发现BA可以抑制TNF-α引起的血管内皮细胞内活性氧(ROS)含量增加，达到血管保护作用[31]。BA还可以抑制LPS引起的ROS增加以及髓过氧化物酶(MPO)活性，延长内毒素致休克小鼠的生命[32]。在LPS引起的急性肺损伤模型中，小鼠经BA治疗后可以提高小鼠体内的抗氧化能力，减少谷胱甘肽(glutathione，GSH)和超氧化物歧化酶(superoxidedismutase，SOD)活性下降[28]。Ekuad等[29]发现在角叉莱构建的胸膜炎中，BA及其类似物干预大鼠后(10 mg/kg、30～100 mg/kg)可以增加胸腔积液过氧化氢酶(catalase，CAT)、GSH、SOD的活性。氧化应激的增加会使得HSCs细胞进一步活化，从而导致纤维化标记物进一步积累，近年SC等[21]发现白桦脂醇和白桦酸均能抑制乙醇诱导的HSCs产生ROS，还发现白桦脂醇和白桦脂酸对乙醇诱导的HSCs产生超氧阴离子和过氧化氢的抑制作用接近50%，且白桦脂醇的抑制作用强于白桦脂酸，这可能是其抑制α-SMA和Ⅰ型前胶原蛋白表达的关键机制之一，并推测白桦脂醇或白桦酸抑制HSC中ROS的产生也可能是通过抑制CYP2E1所致，但还需要进一步的实验。此外也有作者证明BHA可通过抑制缺氧诱导因子(HIF)脯氨酸羟化酶(PhDS)作用来治疗肠纤维疾病如炎症性肠病，这些证据都表明BA可通过抗氧化实现其抗纤维化作用。

2.3 抑制上皮间质转化(EMT) EMT是一个可逆的生物学过程，上皮细胞通过失去细胞极性和钙黏附素介导的细胞黏附获得迁移和侵袭能力，这一过程与器官纤维化、胚胎发育、伤口愈合、和癌症转移和有关[33-34]。研究发现BA在能够诱导肿瘤细胞凋亡并可通过抑制EMT从而抑制癌细胞的迁移和侵袭[35-36]。TGF-β1可诱导早期EMT，下调上皮细胞分子标志物E-cadherin的表达，使得相邻细胞间连接变得疏松，丧失上皮细胞的黏附力，使得上皮细胞迁徙能力增强，逐渐使间质性标记物物ColⅠ、α-SMA的表达量开始逐渐上升，最终使ECM大量沉积。李雅群等[12]通过研究证实BA上调TGF-β1诱导的人肺泡上皮细胞上皮型标志物E-cadherin mRNA表达，下调间质性标志物ColI和α-SMA mRNA及miR-200b-5p和miR-200c-5p表达，Hyp代表细胞外基质胶原含量的特殊氨基酸，实验结果还发现BA均能够下调HYP表达，进一步证实了BA可调节EMT治疗纤维化疾病。

2.4 抑制成纤维细胞的活化 BA可抑制高糖诱导的CFs增殖和肌成纤维细胞分化,从而抑制CFs细胞外基质的表达[13]。BA也可以减少肝脏及肾脏成纤维细胞活化的标志物表达来实现其抗纤维化作用[15，19]。一些研究表明Wnt/β-catenin信号在纤维化形成过程中异常激活，发现BA可抑制Wnt3a诱导的成纤维细胞活化，降低肺成纤维细胞中FN1、Col Ia和α-SmA的RNA和蛋白水平，同时证实BA通过抑制Wnt/β-catenin通路减少成纤维细胞活化；高浓度BA对氯化钨和氯化锂诱导的β-catenin激活的抑制作用甚至可高达90%，对BLM诱导小鼠肺纤维疗效高于一线治疗肺纤维化药物吡非尼酮，但BA对Wnt/β-catenin信号转导的具体作用机制以及BA对肺纤维化相关其他途径的影响还有待进一步研究。成纤维细胞活化是多种疾病病理表现为纤维化的核心，目前有关纤维化疾病机制研究大多停留在炎症层面，而关于成纤维细胞活化的机制较少涉及，这是未来需要进一步阐明的问题。

2.5 调节自噬及细胞凋亡 自噬是胞内物质运送到溶酶体或液泡进行降解的细胞过程，是广泛存在于真核细胞的生命现象，越来越多的证据表明，自噬与纤维化的发生发展关系密切。Liu等[37]研究证明BA可通过抑制PI3K/AKT/mTOR通路诱导癌细胞凋亡和自噬，BA等萜类化合物能通过复杂的信号途径诱导自噬，如MAPK/ERK/JNK、PI3K/AKT/mTOR、AMPK、NF-κB和活性氧[38]。在纤维化中，BA通过丝裂原活化蛋白激酶/细胞外信号调节激酶(MAPK/ERK)途径诱导自噬减轻小鼠肝纤维化，在核酸和蛋白水平下调小鼠肝脏α-SmA和ColⅠ的表达，上调自噬蛋白LC3II和ATG7的表达；在体外BA处理的肝星状细胞LC3II表达增加，α-SmA表达降低[20]，证明BA可通过调节自噬途径治疗纤维化疾病。

在纤维化疾病中，使分泌促纤维化细胞因子的细胞凋亡是逆转纤维化的关键。如上述，研究证明BA可调节细胞凋亡、自噬途径而发挥抗肿瘤活性[37-38]。Caspase-8可裂解并激活下游的效应因子caspases-3，导致细胞凋亡。wan等[19]发现BA通过上调caspase-8和caspase-3的表达诱导活化的HSC-T6细胞凋亡延缓肝纤维化，证明了细胞凋亡可能与BA潜在的抗纤维化的保护机制有关。虽然BA可通过调节自噬及细胞凋亡延缓纤维化进展，但是有关BA凋亡、自噬机制研究目前在肿瘤方面研究较多，在纤维化疾病中研究非常少，需要进一步探索。

3 桦木酸的局限性

BA具有较低的毒性，当用量达500 mg/kg时仍未表现出明显的毒性。试验动物证实BA(20 mg/kg、50 mg/kg)干预后的大鼠血清转氨酶、肝组织羟脯氨酸含量、体质量、相对肝重指数和肝细胞形态仅有轻微变化。BA(12.5～100 LM)对正常人的HSC作用24 h后，细胞活力未见明显改变，表明BA毒性作用低，然而它的低溶解度和口服生物利用度阻碍了其进一步的发展[39-40]，为了提高BA抗纤维化的疗效，人们制备了各种衍生物，如桦木酸异羟肟酸盐(BHA)或是联合使用其他五环三萜类化合物来放大其生物学效应，这也是未来研究的一个方向，但是目前国内外研究BA热点在肿瘤邻域，而有关BA抗纤维化的研究很少，其抗纤维化核心机制还未得到具体阐明。

4 展望

综上所述，BA在多种纤维化模型中表现出了抗纤维化作用，但目前研究主要集中在抗肿瘤方面，抗纤维化机制国内外研究相对匮乏。本文综述体现了桦木酸可通过多个靶点抗不同器官纤维化，但研究尚且不足，故下一步研究目标是基于BA在上述纤维化器官的研究基础上进一步探索BA抗纤维化其他机制。为开发推向临床抗纤维化药物提供理论依据，这可以借鉴BA抗肿瘤及齐墩果酸等五环三萜类抗纤维化的研究，这不仅能够深刻地揭示桦木酸类药物治疗纤维化疾病的本质，而且为临床纤维化疾病的诊断和治疗提供新的思路，BA毒性低、广泛存在于自然界，具有广阔的开发与应用前景，期待未来更多研究去证实。