半夏泻心汤及其拆方改善炎症性肠病肠道免疫的潜在靶点及作用机制的网络药理学分析*

霍敏峰，岳 娟，董秋梅，刘喜平，刘 君，张媛媛，李明成

(1.甘肃中医药大学基础医学院，甘肃 兰州 730000；2.甘肃省中医方药挖掘与创新转化重点实验室；3.内蒙古医科大学中医学院)

炎症性肠病(inflammatory bowel disease,IBD)分为溃疡性结肠炎(ulcerative colitis,UC)和克罗恩病(Crohn’s disease,CD)[1]。IBD的发病率和流行率全世界都在增加，但在西化地区最高[2]。最近流行病学数据显示，近年来国内IBD的发病率在过去20年里急剧上升[3]。研究认为，环境[4]、饮食[5]、卫生、压力和生活方式等因素与国内IBD发病率的增加有关。家族史[6-7]和使用抗生素[8]等被认为是一些诱因。遗传学研究表明，宿主-微生物相互作用在IBD的发病机制中起着重要作用，涉及调节微生物防御和肠道炎症的基因组区域[9]。本病发病机制目前尚不明确[10]，西医多采用免疫抑制剂和抗炎药或生物制剂，其目标是减轻疾病的进展和并发症，提高患者生活质量，但目前治疗方案仍难以满足临床需要。

IBD 属中医学 “泄泻”、“痢疾”、“腹痛”以及 “肠痈”等范畴。中医学认为，其病因多与先天不足、饮食、七情以及外邪等有关。病位主要在肠，并与肝、脾、肾和肺等脏腑相关。半夏泻心汤出自东汉著名医家张仲景之《伤寒论》，为辛开苦降、寒温互用、补泻兼施的代表方剂，且在《金匮要略》已有本方治疗类似疾病的经验记载，如《金匮要略·呕吐哕下利病脉证治》说“呕而肠鸣，心下痞者，半夏泻心汤主之。……下利，寸脉反浮数，尺中自涩者，必清脓血”。鉴于IBD涉及多方面的致病因素，不能通过干预单一靶点奏效，而方剂具有多靶点、多成分、多途径的特性，遵从“君、臣、佐、使”的配伍原则。已有研究表明，网络药理学强调对信号通路的多途径调节，具有提高药物的治疗效果、节省药物研发费用等优势，注重多成分、多靶点、多途径的协同作用关系，有助于全面、深入阐释其作用机制，故本研究采用网络药理学的相关原理及方法，分析半夏泻心汤及其拆方的药物有效成分及对IBD的疾病靶点，对筛选出来的主要靶点及通路进行预测分析，从而探讨半夏泻心汤及其拆方改善炎症性肠病肠道免疫的作用机制，为后续实验、临床研究提供依据。

1 材料与方法

1.1数据库及软件 运用 TCMSP 数据库(https://tcmspw.com/tcmsp.php)分别收集各味中药的有效成分；应用 GeneCards数据库(https://www.genecards.org/)、OMIM数据库(https://www.omim.org/)收集疾病基因靶点；利用Uniport数据库(http://www.uniprot.org/)、R 4.0.2 软件及Perl语言对靶点蛋白标准化；再应用Venny 2.1(http://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)软件绘制韦恩图；利用Cytoscape 3.7.0软件构建网络图；利用STRING 11.0数据库(string-db.org/cgi/input.pl)进行蛋白质相互作用的分析；最后运用 R 4.0.2 软件及 Perl 语言进行GO与KEGG富集分析。

1.2半夏泻心汤及其拆方中药有效成分筛选及相关靶点预测 应用中药系统药理学分析平台(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform,TCMSP)分别检索半夏、干姜、黄芩、黄连、人参、大枣、甘草7味中药的全部有效化学成分，并根据TCMSP数据库中成分毒药物动力学参数(ADME)，以口服生物利用度(oral bioavailability,OB) ≥ 30 %、类药性指数(drug-like index,DL) ≥ 0.18 标准进行筛选，以确定半夏泻心汤及其拆方中所有中药的有效活性成分。利用Uni Prot(http://www.uniprot.org)数据库得到所有对应靶点信息的official gene symbol，用于后续的数据分析。

1.3IBD疾病相关靶点获取 以“Inflammatory bowel disease”为关键词于Gene Cards数据库、OMIM数据库检索并收集IBD疾病相关的靶点基因，对二者收集的结果进行整理，删除多余重复的靶点即为IBD疾病相关靶点。

1.4药物-疾病交互靶点的筛选 利用Venny 2.1在线工具，导入药物潜在作用靶点、IBD疾病靶点后绘制半夏泻心汤原方及其拆方与IBD疾病靶点的韦恩图，并得到方药与疾病交互靶点的蛋白名称。

1.5构建“药物-成分-靶点-疾病”网络 整理交互靶点并分别标识疾病、药物、成分、靶点等对应属性，将所有数据导入Cytoscape 3.7.0软件，绘制“药物-成分-靶点-疾病”相互作用的网络图。

1.6构建蛋白质相互作用网络 将筛选得到的交互靶点蛋白导入到STRING 数据库，限定研究物种选择“Homo sapiens”，隐藏游离点后分析蛋白与蛋白的相互作用，并绘制PPI网络图。

1.7GO与KEGG通路富集分析 应用 R语言将得到的核心靶点进行GO与KEGG 富集分析。GO功能分析主要用于分析基因靶点的功能，KEGG富集分析可以得到半夏泻心汤及其拆方与IBD共同靶点所富集的信号通路。GO和 KEGG分析选择P<0.01为筛选标准，表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1药物、疾病靶标预测结果 通过 TCMSP 数据库收集、筛选半夏泻心汤原方符合标准的有效成分共有129个，辛开组(半夏+干姜)的有效活性成分43个，苦降组(黄芩+黄连) 的有效活性成分104个，甘补组(人参+甘草+大枣)的有效活性成分121个。通过Gene Card、OMIM数据库中检索到6 161个IBD相关靶点基因。见表1。运用Venny软件对方药及疾病取交集并绘制韦恩图(图1)，得到药物-疾病交互靶点。

表1 药物-疾病交互靶点

图1 药物-疾病交互靶点Venn图

2.2构建“药物-成分-靶点-疾病”相互作用网络 利用Cytoscape 3.7.0软件，导入相应文件后构建“药物-成分-靶点-疾病”相互作用网络(图 2)。网络中绿色表示IBD疾病靶点，粉色表示化合物成分靶点，每条连线则表示每组药物与其活性成分、活性成分与作用靶点、作用靶点与IBD之间的相互作用关系。从图2可知，半夏泻心汤组中Quercetin、Beta-sitosterol、Kaemoferol、Stigmasterol、Baicalein等药物活性成分与PTGS1、AR、ESR1、PRSS1、PPARG等IBD疾病靶点关系较为密切；辛开组中Beta-sitosterol、Baicalein、Stigmasterol、Cavidine、coniferin等药物活性成分与PTGS1、CHRM1、CHRM3、PGR、AR等IBD疾病靶点关系较为密切；苦降组中Quercetin、Baicalein、Wogonin、Beta-sitosterol、acacetin等药物活性成分与PTGS1、AR、PRSS1、ESR1、CHEK1等IBD疾病靶点关系较为密切；甘补组中Quercetin、Kaemoferol、Beta-sitosterol、Stigmasterol、Isorhamnetin等药物活性成分与ESR1、PPARG、AR、PTGS1、PRSS1等IBD疾病靶点关系较为密切。

图2 药物-成分-靶点-疾病相互作用网络

2.3PPI 网络的构建及其关键靶点的筛选 将每组映射得到交互靶点导入STRING数据库进行PPI网络分析，得到核心蛋白相互作用网络图(图 3)。每一个节点代表蛋白及其结构，蛋白与蛋白之间的连线代表二者之间的相互作用，不同颜色的线条代表不同的意义，如蓝色表示蛋白同源性，黑色表示二者共表达，黄色表示挖掘文献的证据等。运用R语言进一步分析核心蛋白相互作用的频次，绘制前30位核心靶蛋白相互作用频次的柱状图，横坐标数值表示蛋白的相互作用频次，数值越大则说明靶标蛋白重要性越大，并由此推测这些靶点很可能是各中药组治疗IBD的关键靶点。见图 4。

图3 药物—疾病交集作用靶蛋白相互作用(PPI)网络图

图4 核心靶蛋白相互作用频次的柱状图

将数据导入 Cytoscape 3.7.0软件中，使用“Network Analyzer”插件对 PPI 网络进行分析。图中节点的大小表示度值的大小，节点越大，对应的 Degree 值越大；线条的粗细表示 Combine score，线条越粗Combine score值越大，表示该节点蛋白与其他节点作用网络越广泛。见图 5。

图5 靶点相互关系图

2.4GO功能富集分析 运用 R 软件将作用靶点进行GO富集分析，得到柱状图。柱状图的颜色表示对应基因的P值显著性，颜色越红则表示富集程度越多(图6)。通过图的结果可以看出GO富集后，半夏泻心汤原方中交互靶点主要参与DNA结合转录激活活性、RNA聚合酶II-specific、DNA结合转录因子结合、RNA聚合酶II-specific dna结合转录因子绑定等过程；辛开组中交互靶点主要参与DNA结合转录激活活性,RNA聚合酶II-specific、核受体活性、ligand-activated转录因子的活动等过程；苦降组中交互靶点主要参与DNA结合转录激活活性、RNA聚合酶II-specific、DNA结合转录因子结合、ubiquitin-like蛋白连接酶结合等过程；甘补组中交互靶点主要参与DNA结合转录激活活性、RNA聚合酶II-specific、DNA结合转录因子结合、RNA聚合酶II-specific DNA结合转录因子绑定等过程。

图6 各组药物对IBD作用靶点的GO富集分析图(条状图)

2.5KEGG 富集结果分析 进行KEGG通路富集分析，以P<0.01为筛选标准进行筛选，得到各组信号通路：半夏泻心汤组122条，辛开组68条，苦降组104条，甘补组120条。按照显著性程度P值由小到大选取前10条通路进行部分展示(表2-表5)。根据结果可以看出 ，在半夏泻心汤组中，RELA 、BCL2、CASP9、CCND1、FOS等基因相关通路显著性较高；辛开组中，RELA 、BCL2、FOS、CASP3、CYCS等基因相关通路显著性较高；苦降组中，RELA 、EGFR、CCND1、VEGFA、CASP9等基因相关通路显著性较高；甘补组中，MAPK10、GSK3B、RELA 、IKBKB、BCL2等基因相关通路显著性较高。

表2 半夏泻心汤组KEGG通路富集条形图潜在靶点信息表

表3 辛开组KEGG 通路富集条形图潜在靶点信息表

表4 苦降组KEGG 通路富集条形图潜在靶点信息表

表5 甘补组KEGG 通路富集条形图潜在靶点信息表

半夏泻心汤组在治疗IBD所涉及到的通路中，Kaposi sarcoma-associated herpesvirus infection、Hepatitis B信号通路显著性、富集数目均较高，关键靶点中的大部分基因富集于这条通路上。Human immunodeficiency virus 1 infection、Hepatitis B信号通路在辛开组治疗IBD所涉及到的通路中显著性、富集数目较高；苦降组中，PI3K-Akt 、Kaposi sarcoma-associated herpesvirus infection信号通路显著性、富集数目较高；甘补组中，Kaposi sarcoma-associated herpesvirus infection、Fluid shear stress and atherosclerosis信号通路显著性、富集数目较高，关键靶点中的大部分基因富集于这条通路上，表明这两条信号通路极有可能是甘补组治疗IBD的关键信号通路。见图 7。

图7 各组药物对IBD作用靶点的KEGG富集分析图(气泡图)

3 讨论

半夏泻心汤由半夏、黄芩、黄连、炙甘草、干姜、人参、大枣七味药组成，方中以辛温之半夏为君，散结除痞，又善降逆止呕；干姜温中散寒，黄芩、黄连苦寒泄热为臣药；佐以人参、大枣甘温益气、补脾虚；使以炙甘草补脾和中，调和诸药，全方共奏寒热平调，散结除痞之功效，配伍具有寒热并用、辛开苦降、补泻兼施特点。相关研究表明，半夏泻心汤可通过减少p38MAPK/NF-κB表达减轻炎症反应从而发挥对重症急性胰腺炎(SAP)肠黏膜屏障损伤的保护作用[11]。另对缓解期UC患者使用半夏泻心汤加减内服结合中药保留灌肠治疗，能有效调节患者肠道内菌群平衡，促进黏膜恢复，改善症状[12]。基于网络药理学具有系统性、整体性的特征，与中医药整体观相吻合，本实验采用网络药理学方法，研究半夏泻心汤及其拆方对炎症性肠病肠道免疫的潜在靶点及作用机制，系统分析半夏泻心汤及其拆方的有效成分，预测治疗IBD的相关靶点，构建了药物-疾病-靶点网络。

通过对药物-靶点网络分析得出半夏泻心汤治疗IBD的主要成分是Quercetin(槲皮素)、Beta-sitosterol(β-谷甾醇)、Kaemoferol(山柰酚)、Stigmasterol(豆甾醇)、Baicalein(黄芩素)；辛开组治疗IBD的主要成分是Beta-sitosterol(β-谷甾醇)、Baicalein(黄芩素)、Stigmasterol(豆甾醇)、Cavidine(卡文定碱)、Coniferin(松柏苷)；苦降组治疗IBD的主要成分是Quercetin(槲皮素)、Baicalein(黄芩素)、Wogonin(汉黄芩素)、Beta-sitosterol(β-谷甾醇)、Acacetin(金合欢素)；甘补组治疗IBD的主要成分是Quercetin(槲皮素)、Kaemoferol(山柰酚)、Beta-Sitosterol(Β-谷甾醇)、Stigmasterol(豆甾醇)、Isorhamnetin(异鼠李素)等。有研究表明槲皮素具有抗氧化、抗炎以及抗癌等生物活性[13]，可通过降低脂质过氧化产物丙二醛含量和提高超氧化物歧化酶活性，减少氧化诱导的细胞凋亡[14]；另有研究证实槲皮素可增加抗凋亡BCL2蛋白表达、降低促凋亡BAX 蛋白表达及CASP3活性，减少经线粒体途径介导的细胞凋亡[15]。山柰酚是人参的重要成分，是一种有抗炎、抗氧化等作用的黄酮类化合物，已有研究证实山柰酚具有很好的抗炎特性，能够抑制促炎因子肿瘤坏死因子α(TNF-α)释放，增加抑炎因子白介素10(IL-10)的表达和分泌[16]；豆甾醇能显著抑制结肠缩短，降低结肠炎的严重程度，显著降低炎症因子IL-1β、IL-6、MCP-1和相关环氧合酶COX-2。β-谷甾醇对环氧合酶中的COX-2的表达亦有抑制作用，这对炎症性肠病具有十分重要的治疗价值[17]。IBD的炎症反应之所以会产生和持续，与一些关键细胞因子的表达密切相关，在炎症过程中IL-1β、IL-6、COX-2和MCP-1的表达会随着严重程度的增加而上升。黄芩苷和汉黄芩素则已被证实具有抗病毒、抗炎、抗补体作用。

KEGG富集分析后发现半夏泻心汤组中RELA 、BCL2、CASP9、CCND1、FOS等基因相关通路显著性较高，辛开组中RELA 、BCL2、FOS、CASP3、CYCS等基因相关通路显著性较高；苦降组中RELA 、EGFR、CCND1、VEGFA、CASP9等基因相关通路显著性较高；甘补组中MAPK10、GSK3B、RELA 、IKBKB、BCL2等基因相关通路显著性较高。RelA(p65,NF-κB3)是一个转录因子，存在于NF-кB蛋白家族中[18]，NF-κB 在细胞增殖、细胞迁移、炎症反应中均起着重要作用。NF-κB表达上调会导致 TGF-β、趋化因子等细胞因子的释放[19]，BCL2家族蛋白在细胞凋亡中的作用根据结构和功能分为两类：一类是以BCL2为代表的抗凋亡蛋白；一类是以BAX为代表的促凋亡蛋白。BAX 与 BCL2具有同源性，是促进细胞凋亡的主要基因[20]。BCL2与 BAX可互相结合形成异源二体，阻断细胞色素C释放抑制CASP3蛋白的活化最终抑制细胞凋亡[21-22]。细胞凋亡是通过对体内和体外多种因素的刺激，从而激活细胞的死亡过程。上皮细胞凋亡的增加可能会增大发生肠道损伤的风险[23]。BAX 蛋白是BCL2家族中研究最广泛的促凋亡蛋白。BAX /BCL2比率增加，线粒体释放细胞色素C增多，诱导肠壁损伤[24]，肠黏膜BCL2表达会增加[25]。CASP3、CASP9 皆属于天冬氨酸特异酶切的半胱氨酸蛋白酶(cysteinyl aspartate specific proteinases，Caspases)蛋白家族，而Caspases家族是细胞程序性死亡过程中的关键元件，因此又称死亡蛋白酶。细胞凋亡主要由凋亡相关胱天蛋白酶(如CASP3 /8 /9) 介导，细胞发生非炎症性坏死[26]。其中CASP3位于凋亡有序级联反应的下游，是细胞凋亡的重要执行者，是凋亡刺激信号传递的汇聚点，它的活化标志着细胞凋亡进入不可逆阶段[27]。大多数触发细胞凋亡的因素，最终都要通过CASP3介导的信号传递途径致使细胞凋亡。

KEGG通路富集分析结果显示半夏泻心汤组可能通过AGE-RAGE、TNF等信号通路起到治疗IBD的作用；辛开组中P53信号通路、苦降组中P13K-Akt、AGE-RAGE、P53、TNF信号通路以及甘补组中AGE-RAGE、TNF信号通路显著性、富集数目均较高。每组中关键靶点中的大部分基因富集于这些通路上，表明这些信号通路极有可能是各组中药治疗IBD的关键信号通路。此外，Kaposi sarcoma-associated herpesvirus infection(卡波西肉瘤相关疱疹病毒感染)信号通路和Hepatitis B(乙型肝炎)、Human immunodeficiency virus 1 infection(人类免疫缺陷病毒1感染)信号通路、Fluid shear stress and atherosclerosis(流体剪切应力和动脉粥样硬化)信号通路显著性、富集数目均较高。AGE-RAGE通路全称为晚期糖基化终末产物(advanced glycosylation end products,AGEs)-糖基化终末产物受体(receptor of AGEs，RAGE)信号通路。有研究表明，AGEs多由大分子物质(蛋白质、脂质或核酸等) 在非酶催化条件下与还原性单糖反应所生成的一种稳定的不可逆聚合物。AGEs可在内皮细胞、毛细血管基底膜沉积，降低血管通透性，诱发视网膜屏障损伤[28]。卡波西肉瘤相关疱疹病毒(KSHV)是一种新兴的病原体，是Kaposi肉瘤和两种B细胞源性恶性肿瘤的病原体，迄今为止还没有获得许可的KSHV疫苗[29]。KSHV病毒天然宿主是人的内皮细胞和B淋巴细胞。在体内，KSHV已在B细胞、上皮细胞、内皮细胞、成纤维细胞、单核细胞和副内皮梭形细胞中检测到69例[30-31]。在体外，它广泛感染人类71和非人类起源的B细胞、上皮细胞、内皮细胞、单核细胞和成纤维细胞系[32,33]。KSHV感染内皮细胞可诱导炎性细胞因子Ang - 2的产生和分泌，Ang - 2可促进单核细胞向KS肿瘤中迁移和募集[34]。KSHV感染内皮细胞后，除了IL-6、IL-10、IL-13和vIL-6外，还会诱导干扰素的表达[35]。P13K-AKT通路是经典的细胞周期控制通路之一，主要参与滑膜炎症中白细胞趋化、吞噬过程，以及炎性因子分泌及NF-κb的活化[36-37]。TNF信号通路与机体内炎症因子分泌密切相关，通过与TNFR1受体结合，引起NF-κB、p38α及其下游效应激酶MK2的激活，从而促进靶基因的转录，mRNA的稳定和翻译[38]。

综上所述，结合IBD目前的病理机制、临床诊疗相关的研究分析，从系统层面阐明该半夏泻心汤及其拆方可能在改善肠道黏膜屏障、抗炎等方面发挥重要作用，从而揭示其潜在的作用靶点和信号通路，这与复方治疗疾病的多成分、多靶点、多通路的特点有关，为进一步阐明半夏泻心汤及其拆方治疗IBD的可能理论机制提供科学依据。