表观遗传调控植物叶片衰老的研究进展

陈 烨,刘平丽

(北京林业大学 生物科学与技术学院,北京 100083)

叶片是植物进行光合作用的主要器官,是植物生长发育过程中能量和营养物质的主要来源,叶片衰老是整个植物体衰老的重要部分。叶片衰老过程中,叶色由绿色变成黄色或红色,细胞内细胞器发生解体、生理代谢和基因表达发生明显变化[1-4]。叶片衰老涉及叶绿素和蛋白质等大分子物质的分解,营养物质从叶片供应给正在生长发育中的种子或者果实或者木本植物的根和茎。过早衰老会降低作物的产量和质量,限制花卉瓜果的观赏和保存,也会影响多年生植物如树木次年春天叶芽和花芽的生长发育[3-4]。因此,有序的叶片衰老是确保植物产生优良后代和更好生存的关键过程。

叶片衰老具有年龄依赖性,主要受发育调控,但同时也受内部和外部环境因素如激素、光照、温度及胁迫因子的影响。它们相互作用形成一个复杂且环境敏感的调控网络在时空上精确调节叶片的衰老过程[4-6],引起衰老相关基因表达模式的变化[7]。植物衰老过程中,表达上调的基因,被称为衰老相关基因(senescence associated genes,SAGs)。目前在拟南芥、玉米、小麦、番茄和木本植物杨树等多种植物中已经分离出数千种SAGs,并且对数百个SAGs进行了功能鉴定[8-10]。这些SAGs基因表达的水平主要由转录因子调控,目前NAC、WRKY、AP2/EREBP、MYB、bHLH、bZIP等转录因子家族中的成员已被证实在植物叶片衰老过程中对SAGs基因的表达有重要的调控作用[10-13]。其中,NAC转录因子和WRKY转录因子被认为在叶片衰老中起到了核心调控作用[14-15]。

叶片衰老涉及到多层次复杂的调控,可以在转录、转录后、翻译和翻译后等多个水平整合内外信号进行精细的调控[3]。最近的研究表明表观遗传调控也在植物叶片衰老过程中发挥着重要作用[5,16-17]。表观遗传是不改变DNA序列的情况下,使基因表达发生可遗传和可逆改变的一种调控方式,主要包括组蛋白修饰、DNA甲基化、ATP依赖的染色质重塑和非编码RNA介导的调控[18]。目前研究主要关注于组蛋白甲基化、乙酰化和DNA胞嘧啶的甲基化如何调控基因的表达从而影响植物生长发育的进程。此外,随着测序技术的发展,越来越多的非编码RNA被发现,其在叶片衰老过程中的调控作用逐渐引起人们的重视。非编码RNA(ncRNAs)是一类不翻译成蛋白质的RNA,主要包括非编码小RNAs(small non-coding RNAs,sncRNAs)、微小RNAs(miRNAs,microRNAs)和反式小干扰RNAs(trans-acting small interfering RNAs,ta-siRNAs)、长链非编码RNAs(long non-coding RNAs,lncRNAs)、环状RNAs(circular RNAs,circRNAs)和piRNAs(Piwi-interacting RNAs)等。它们在植物生长发育、抵御胁迫以及衰老调控方面有重要作用。本文综述了表观遗传在植物叶片衰老过程中调控的研究进展,以期进一步促进植物叶片衰老的表观遗传调控研究。

1 组蛋白修饰调控植物叶片衰老

组蛋白(Histone)是一种可以和DNA结合的碱性蛋白,在真核生物细胞核中,组蛋白和DNA共同组成染色质的基本单位核小体,H2A、H2B、H3和H4 4种组蛋白组成了核小体的蛋白质八聚体。组蛋白尾部的蛋白结构域延伸在核小体表面,具有多个修饰位点,可以在不同酶的作用下进行甲基化、磷酸化、乙酰化和泛素化等组蛋白修饰,改变核小体构象,调控基因转录活性[19-20]。

1.1 组蛋白甲基化

在拟南芥中,组蛋白甲基化可发生在组蛋白H3的赖氨酸残基4 (K4)、9 (K9)、27 (K27)和36 (K36)位点。通常情况下,组蛋白H3K4和H3K36甲基化与基因的转录活化相关,而组蛋白H3K9及H3K27甲基化则与基因的沉默相关[21]。多项研究表明,H3K4me3可以激活SAGs表达从而在叶片的自然衰老过程中起重要的调控作用,H3K27me3则以相反的方式来调控SAGs的表达。WRKY53是调控叶片衰老的关键转录因子。Ay等[22]的研究表明了组蛋白甲基化修饰与植物叶片衰老相关,他们发现随着拟南芥叶片衰老,转录因子WRKY53基因编码区5′端,组蛋白甲基化H3K4me2和H3K4me3信号有明显增加,WRKY53基因转录被活化。Brusslan等[23]也对成熟和衰老的拟南芥叶片中组蛋白修饰H3K4me3和H3K27me3与基因表达水平的关系进行了探究,发现衰老叶片中衰老上调基因的H3K4me3标记增加,下调基因的H3K4me3标记减少。而失去H3K27me3标记的基因在衰老时出现了上调,少数H3K27me3标记增加的基因在衰老叶片中表达水平下调。Yan等[24]利用了ChIP-Seq及RNA-Seq研究了黑暗胁迫下拟南芥叶片中基因组范围内H3K4me3的分布,以及H3K4me3与基因表达的关系。他们发现经黑暗处理后叶片中H3K4me3标记数量整体上增加,H3K4me3标记增加的基因主要参与叶片衰老。这些基因包括衰老相关基因WRKY6、SAG113和SAG101,以及与黑暗诱导衰老相关的基因ABI5、EIN3和ORE1。研究结果说明H3K4me3在SAGs的转录调控中起到了重要的作用,并且黑暗诱导和年龄引起的叶片衰老之间存在着相互应答(cross-talk)。

组蛋白甲基化状态主要由组蛋白甲基转移酶(histone methyltransferases,HMTs)和组蛋白去甲基化酶(histone demethylases,HDMs)共同维持,多个研究表明HMTs和HDMs参与了叶片衰老的调控。SUVH2属于HMTs,其过表达导致H3K9、H3K27异染色质甲基化标记增加[25]。Ay等[22]发现SUVH2过表达植株中WRKY53基因的H3K27me2和H3K27me3标记水平升高,导致WRKY53及其下游的衰老相关基因SIRK、SAG101、ANAC083、SAG12和SAG24的转录受到抑制,叶片出现衰老延迟。Ay等[26]通过qRT-PCR分析发现过表达SUVH2影响50%衰老相关调控基因的表达,其中,衰老相关转录因子家族AP2-EREBP、C2H2、NAC和WRKY受到的影响尤为显著。组蛋白去甲基化酶HDMs可以分成2种类型:JMJs(JmjC domain-containing proteins)和LSD1(lysine-specific demethylase 1)。Wang等[21]在拟南芥中发现组蛋白H3K27me3去甲基化酶REF6/JMJ12,可以通过去甲基化激活衰老调控基因和结构基因如EIN2、ORE1、NAP、PPDK、LOX1和NTL9等的表达,正向调控叶片衰老。Liu等[27]发现组蛋白去甲基化酶JMJ16在拟南芥中通过移除WRKY53和SAG201位点的H3K4me3水平,抑制这些基因的提前表达,对叶片衰老有负调控作用。Ding等[28]证明了番茄组蛋白去甲基化酶SIJMJ4的过表达促进黑暗和ABA诱导的番茄叶片衰老。在黑暗中,SIJMJ4通过去除H3K27me3促进转录因子SlORE1、SlNAP2和衰老相关基因SlSAG113、SlSAG12的表达促进衰老。响应ABA时,SIJMJ4可以降低上述基因和SlABI5、SlNCED3等衰老相关基因的H3K27me3水平,激活它们表达,介导ABA诱导的叶片衰老。

这些研究结果都表明植物叶片衰老受组蛋白甲基化和去甲基化的调控,此外Yan等[24]和Ding等[28]的结果表明除年龄诱导的叶片衰老外,组蛋白甲基化在黑暗和ABA诱导的叶片衰老过程中也有参与,对于组蛋白甲基化修饰在其他因素诱导的叶片衰老调控过程中的作用值得更加深入研究。

1.2 组蛋白乙酰化

除了组蛋白甲基化修饰,乙酰化也是一种重要的组蛋白修饰方式。组蛋白乙酰化与基因转录激活有关,去乙酰化与基因沉默有关。同样受酶的作用,由组蛋白乙酰转移酶(histone acetyltransferase,HATs)和组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylases,HDACs)共同作用参与调控植物叶片衰老[29]。

Brusslan等[30]利用ChIP-Seq及RNA-Seq研究了拟南芥发育衰老过程中不同时间点叶片中H3K9ac和H3K4me3的丰度,他们发现大部分衰老上调相关基因都有H3K9ac和H3K4me3标记。他们还发现SAGs周围的H3K9ac水平在衰老早期较高,随着衰老的进行逐渐降低。这与H3K4me3水平的情况相反,H3K4me3水平通常在衰老的早期阶段很低,在衰老阶段结束时急剧增加。组蛋白标记在整个衰老过程中高度收敛。然而,SAGs周围H3K4me3标记覆盖的基因区域的平均数量几乎是H3K9ac标记覆盖的2倍。植物中的去乙酰化酶可分成3个家族:RPD3/HDA1、HD2和SIR2[31]。AtHD1是一种组蛋白去乙酰化酶。Tian等[32]研究发现,AtHD1的组成型反义抑制转基因植株CASH中的H4组蛋白高度乙酰化,植株表现出早衰现象。AtHD1的T-DNA插入突变体也出现乙酰化水平的增加和相似的早衰表型[33]。HDA6是组蛋白去乙酰化酶的一种,根据Wu等[34]的研究,拟南芥HDA6缺失突变体组蛋白H3乙酰化水平高于野生型,衰老相关基因SAG12和SEN4的表达下调,叶片衰老延迟,表明HDA6参与了拟南芥叶片衰老的调控。HDA9是组蛋白去乙酰化酶,拟南芥hda9和pwr突变体自然条件和黑暗诱导下衰老延迟,Chen等[35]的研究表明HDA9、蛋白质PWR和转录因子WRKY53一起通过去除多条衰老调控途径负调控基因的H3K27ac标记,从而抑制它们的表达,这反过来又诱导它们下游靶基因解除抑制来促进叶片衰老。Huang等[36]研究发现HDA15与单链DNA结合蛋白WHIRLY1互作,去除营养循环基因和衰老相关基因WRKY53启动子区的H3K9ac,从而抑制它的表达,进而抑制叶片衰老。

拟南芥CBP/p300 HAT家族具有组蛋白乙酰转移酶活性, 基因家族成员包括HAC1、HAC2、HAC4、HAC5和HAC12。Li等[37]研究发现,乙酰转移酶AtHAC1的T-DNA插入突变体叶片具有黑暗迟绿的表型;所有AtHAC突变体对乙烯高度敏感,影响叶片衰老的乙烯响应因子(ethylene response factors,ERFs)的表达水平上调,说明AtHAC1与植物叶片衰老相关。Hinckley等[38]利用ChIP-seq鉴定出43个组蛋白乙酰转移酶HAC1的可能靶标,其中靶标ERF022是叶片衰老的正调控因子。以上结果均表明了组蛋白乙酰化这一表观遗传机制在叶片衰老调控中有重要作用。

除了对拟南芥中组蛋白乙酰化在叶片衰老中作用的研究,其他常见植物叶片衰老时组蛋白乙酰化作用也值得关注。Zhang等[39]利用ChlP分析了水稻旗叶衰老不同阶段H3K9ac的全基因组富集情况。随着水稻旗叶的衰老,全基因组H3K9ac出现明显增加。通过对与H3K9ac相关的差异表达基因分析发现,衰老相关基因的表达情况和H3K9ac水平有明显的正相关关系,并且H3K9ac相关的基因主要参与了衰老相关激素信号通路。因此对于更多植物叶片衰老时组蛋白乙酰化的调控作用地研究,可以作为未来研究方向,更全面地了解叶片衰老调控中表观遗传机制的作用。

1.3 其他组蛋白修饰

除了组蛋白甲基化、乙酰化,组蛋白的其他共价修饰方式如磷酸化和泛素化也可能参与了植物叶片衰老的调控。组蛋白的磷酸化位点有丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸,它们在蛋白激酶的作用下磷酸化,并被磷酸酶去磷酸化[40-41]。虽然目前还没有证据表明组蛋白磷酸化参与了植物叶片衰老的调控,但多种蛋白激酶和磷酸化酶被证实在叶片衰老过程中具有重要作用调控的研究[42-43],说明组蛋白磷酸化可能参与了植物叶片衰老的表观遗传调控。

H2A是第一个被发现的可以被泛素化修饰的组蛋白。组蛋白泛素化修饰涉及E1泛素激活酶、E2泛素结合酶和E3泛素连接酶。拟南芥中只有2个基因编码E1酶,而编码E2和E3酶的基因分别有41和1 300多个[44]。Polycomb蛋白复合体(Polycomb group proteins)通过组蛋白修饰,在表观遗传方面调控靶基因[45],该蛋白复合体亚型PRC1复合物具有H2A泛素化E3连接酶活性,可以催化H2A泛素化[46],BMI1A是该复合体的成员之一。研究表明组蛋白H2A的泛素化修饰参与了植物叶片衰老调控。Chen等[47]在高粱中研究发现,乙烯信号途径的关键转录因子EIN3的下游靶基因SbWRKY50通过与SbBMI1A互作,进而招募PRC1引起叶绿素降解途径关键基因上的组蛋白H2Aub富集,抑制了叶绿素的降解,延缓了高粱叶片的衰老。虽然目前关于组蛋白泛素化参与植物叶片衰老调控的直接证据较少,但拟南芥叶片衰老过程中E3泛素连接酶与去泛素化酶(deubiquitination enzymes,DUB)都起到了一定的调控作用[48-51],说明泛素化参与了植物叶片衰老调控,但组蛋白泛素化修饰的机制和在调控叶片衰老过程中的具体作用还值得进一步研究。另外组蛋白泛素化与其他组蛋白修饰间具有相互作用[48],通过组蛋白其他共价修饰,也可能是组蛋白泛素化调控植物叶片衰老的一种间接方式。

2 DNA甲基化调控植物叶片衰老

DNA甲基化(DNA methylation)在植物体中广泛存在,由DNA甲基转移酶(DNA methyltransferase,DMT)催化。DNA序列上CG、CHG、CHH(H是A、T或C)3类位点上的胞嘧啶可以发生甲基化。参与调控的甲基化转移酶主要包括:MET1、CMT3和DMRs[52]。DNA甲基化可以发生在转座子(TFs)等重复序列上,使重复序列沉默来维持异染色质结构稳定。DNA甲基化可以改变基因启动子或编码区的甲基化水平,进而影响基因与转录因子的结合能力[53]。目前研究表明,DNA甲基化影响着植物叶片衰老过程。

Ogneva等[54]研究了拟南芥与年龄相关的DNA甲基转移酶基因(AtMETI、AtDRM1和AtDRM2)和去甲基化酶基因(AtROS1、AtDME、AtDML2和AtDML3)的表达情况,随着叶片衰老,DNA去甲基化酶基因的表达量明显高于幼叶时期,而DNA甲基转移酶基因呈现出相反的表达模式,说明在拟南芥叶片衰老过程中有DNA去甲基化的参与。Dou等[55]对棉花幼叶和衰老叶全基因组DNA甲基化水平进行了比对分析,衰老叶DNA甲基化水平低于幼叶,并且研究的9个DNA甲基转移酶相关基因和2个DNA去甲基转移酶相关基因的表达均在衰老过程中被下调。表明DNA甲基化活性降低调控了叶片的衰老。在超砷积累的凤尾蕨中发现,砷的积累导致叶片中DNA甲基化水平的降低,同时叶绿素的积累和Fv/Fm也有所减少。说明在砷积累的情况下,DNA甲基化影响了叶片光合过程和色素积累[56]。越来越多的研究表明DNA甲基化与衰老相关基因之间存在一定的联系。He等[57]鉴定出拟南芥中的一个转座子NMR19,根据其在基因组中的位置不同分为NMR19-4和NMR19-16,其中NMR19-4的甲基化抑制了调控叶片衰老的PPH的表达,影响了叶片中叶绿素的含量,叶片出现延迟衰老。Yuan等[58]的研究显示DNA去甲基化酶基因DML3调控拟南芥叶片衰老,因为他们发现dml3敲除突变体植株很多SAGs启动子的高度甲基化导致其转录水平降低,叶片出现衰老延迟现象。Li等[59]研究了油菜叶片衰老时DNA甲基化的变化,发现DNA甲基化转移酶基因BcMET1、BcSUVH4、BcDRM2、BcRDR2和BcCMT3的表达随储藏时间延长而逐渐下降,而DNA去甲基化相关基因(BcROS1)的表达保持不变。经甲基化抑制剂5-Aza处理后的叶片中与叶绿素降解相关的酶活性逐渐升高,叶片变黄。衰老相关基因BcSAG12、BcNYC1、BcSGR1、BcSGR2等的表达也出现上调。同时衰老叶片BcSGR2和BcSAG12启动子区域出现了明显的DNA去甲基化,表明了油菜叶采后的叶片衰老相关基因的表达与DNA去甲基化有关。以上实验结果都证明了DNA甲基化影响着植物叶片衰老,但除了甲基化酶和去甲基化酶的作用,发生在TEs的DNA甲基化对叶片衰老表型变化的作用值得进一步研究。

我应承下，把锅碗洗了，就去给二丫洗澡。我脱下二丫的衣裳，她身上密麻麻的新伤旧疤吓了我一大跳。我问二丫：“东洋人弄的？”

值得注意的是,DNA甲基化与组蛋白修饰并不是完全相互独立的表观遗传调控方式。例如拟南芥met1-1突变体中组蛋白H3K9me信号明显减弱,这一结果同样出现在met1-3突变体中,证明DNA甲基化影响了组蛋白H3K9me的水平[60-61]。另外拟南芥组蛋白去乙酰化酶HDA6有维持CHG位点DNA甲基化的作用,在拟南芥Athda6突变体中,CHG甲基化水平明显降低[62],说明DNA甲基化的维持依赖于HDA6,与组蛋白乙酰化水平降低共同使基因沉默。植物DNA甲基化与组蛋白修饰间关系密切,因此深入研究植物叶片衰老中DNA甲基化和组蛋白修饰的共同调控机制,是全面了解植物叶片衰老表观遗传调控的重要研究方向之一。

3 ATP依赖的染色质重塑调控植物叶片衰老

染色质结构的高度重叠成为转录因子与DNA结合的障碍,因此真核生物在进化过程中进化出改变染色质DNA局部可接近性的机制,除了上述提到的组蛋白共价修饰、DNA甲基化以外,还可以通过ATP依赖的染色质重塑(chromatin remodeling)实现[5]。ATP依赖的染色质重塑由ATP水解提供能量,在染色质重塑复合物的参与下,以核小体在DNA上滑动、与DNA解离、去除染色质上的组蛋白八聚体以及组蛋白变异体与经典组蛋白置换的非共价方式,调控染色质结构,从而增加或减弱转录因子在其染色质DNA局部的可接近性,进而激活或抑制相关基因的转录[63]。染色质重塑复合物最早在酵母中被发现,由ATP酶核心亚基和其他亚基组成,根据主要起催化作用的ATP酶核心亚基将染色质重塑复合物分为SWI/SNF、ISWI、Ino80和CHD 4个家族[64-65]。SWI/SNF家族由SWI2/SNF2蛋白与SNF5、SWP73和SWI3亚基组成,其起催化作用的ATP酶核心亚基为SWI2/SNF2亚基[66]。目前在拟南芥中鉴定出了41个含有ATP酶结构域的基因,分为Snf2-like、Swr1-like、Rad54-like等不同家族,其中Snf2-like家族又被分为SWI2/SNF2、Lsh、Iswi、Chd1和Mi-2亚家族[67]。对SWI2 /SNF2亚家族成员有一定研究,包括SYD、BRM、CHR12、CHR2、DDM1、DRM1等染色质重塑因子[68]。转录因子CIN-TCP促进植物叶片衰老,Efroni等[69]研究指出,拟南芥SWI2/SNF2家族成员BRM影响了转录因子CIN-TCP对细胞分裂素的响应,在BRM功能缺失的拟南芥突变体中,观察到了叶片衰老加速的现象。Li等[70]的研究中,发现BRM直接靶向作用于衰老相关基因SAG21、SAG101、SAUL1等,另外H3K27去甲基酶REF6促进BRM的募集,降低H3K27me3水平激活转录,且BRM与REF6共定位衰老依赖基因,因此REF6可能与含BRM的SWI/SNF复合体一起通过控制SAGs基因的染色质结构,进而在表观遗传上调控叶片衰老。另外该家族成员DRD1和DDM1经研究表明参与叶片衰老调控。Cho等[71]研究发现拟南芥drd1-6、ddm1-2突变体叶片均出现衰老延迟现象,并且SAGs表达受到明显抑制,因此他们认为SWI2/SNF2染色质重塑复合物通过表观遗传调控参与叶片衰老过程。AT-hook motif也是组成SWI/SNF的一个非催化活性亚基[67],Lim等[72]发现拟南芥ORE7/ESC过表达使植株出现衰老延迟,ORE7/ESC基因可编码具有AT-hook motif的蛋白质,改变了染色质构象,同样也影响了衰老相关基因的表达水平,因此他们认为ORE7/ESC通过编码具有AT-hook motif的蛋白质,使染色质重塑,进而调控了植物叶片衰老。ATP依赖的染色质重塑在植物叶片衰老调控中有重要作用,根据已有研究可以看出,染色质重塑复合物与组蛋白共价修饰在调控植物叶片衰老方面密不可分,一方面组蛋白共价修饰影响染色质重塑复合物活性,另一方面参与染色质重塑复合物的招募和稳定[64]。虽然实验表明了BRM、DRD1和DDM1等染色质重塑因子在叶片衰老表观遗传的调控作用,但具体的作用方式以及更多亚家族成员的作用仍需要进一步研究。

4 非编码RNA介导调控植物叶片衰老

4.1 非编码小RNAs与叶片衰老调控

非编码小RNAs(small non-coding RNAs,sncRNAs)在植物基因表达调控中有重要作用,通过使mRNA失活或翻译抑制在转录或转录后水平调控基因表达,进而从不同的生物过程参与对植物生长发育起到了调控作用,目前在叶片衰老调控方面研究较多的sncRNAs是miRNAs和ta-siRNAs。

4.1.1 miRNAs参与调控植物叶片衰老MicroRNAs(miRNAs)是在动物、植物中广泛存在的内源性小RNA,长度为18～24个核苷酸[73]。最早于1993年由Wightman等[74]和Lee等[75]在秀丽隐杆线虫(Caenorhabditiselegans)中发现。随后2002年Reinhart等[76]在拟南芥中证明了miRNAs同样存在于植物中。miRNAs序列在动物和植物中均高度保守,通过切割靶基因mRNA在转录后水平调控基因表达。随着小RNA克隆和高通量测序等生物学技术发展,陆续在更多植物中筛选出大量miRNAs[77-78]。不仅在拟南芥中筛选鉴定出大量miRNAs,Xu等[79]在水稻衰老叶片中新鉴定出162个候选miRNAs,并鉴定分析出其靶基因功能与叶片衰老相关;Wu等[80]在玉米叶片中鉴定出81个miRNAs,其中16个miRNAs差异表达与叶片衰老相关。

通过组学分析,人们推测很多的miRNAs可能都参与叶片衰老的调控,但是进行深入的功能分析的miRNAs并不多。miR164、miR319、miR840和miR396是植物中研究得较为深入的被证实参与植物叶片衰老调控的miRNAs。miR164已在拟南芥中被证实靶向调控NAC转录因子家族。Kim等[81]研究了由ORE1、miR164和EIN2组成的网络调控叶片衰老的机制,他们发现衰老早期miR164结合到ORE1/AtNAC2的mRNA上,抑制衰老正向调控因子NAC2的表达。随着叶片衰老,EIN2表达上调,EIN2负调控miR164使其表达量降低,同时NAC2的表达增加从而促进了拟南芥叶片的衰老。Li等[82]研究发现,叶片衰老时,EIN2下游关键转录因子EIN3的转录水平增高,EIN3蛋白能够与miR164启动子结合抑制其转录,同时上调miR164靶基因NAC2的表达而促进衰老,EIN2-EIN3-miR164-NAC2共同构成了调节叶片衰老的信号通路。Wen等[83]利用微列阵技术对幼叶和衰老叶保守miRNAs表达情况进行分析,结果显示衰老相关miR164在幼叶中出现高表达。通过瞬时过表达实验,发现LfNAC1和LfNAC100是lfomiR164b的靶基因,并且LfNAC1可以促进叶片衰老相关基因LfSGR的表达。实验结果说明,miR164在幼叶时期抑制LfNAC1的表达,随着季节的变化miR164逐渐下降,LfNAC1激活叶片衰老相关基因导致叶片衰老,证实了“miR164-NAC”对枫香秋叶衰老的调控作用。这些实验结果证明miR164对叶片衰老的正向调控作用。

miR319也是研究较为深入的参与植物叶片衰老调控的miRNAs之一。研究表明拟南芥miR319靶向作用于与植物生长发育相关的TCPs转录因子家族[84-85]。Schommer等[86]通过微列阵技术鉴定出了5个受miR319靶向调控的TCPs家族成员,其中TCP4正调控茉莉素(jasmonates,JA)生物合成关键基因LOX2,促进JA的生物合成,进而调控植物叶片衰老。Koyama等[87]同样研究了miR319和TCPs转录因子在叶片衰老过程中的作用。研究发现拟南芥TCP3、TCP4基因过表达以及mir319a/b突变体植株的叶片表现出早熟现象,而tcp3/4/10和tcp3/4/5/10/13/17突变体表现出延迟的叶片黄化,说明miR319和TCP基因突变引起的TCPs表达差异调控了叶片衰老。除了在拟南芥这种模式植物中证实了miR319调控叶片衰老的作用,Zhu等[88]发现,鸡爪槭黄叶突变体叶片中miR319转录水平高,而野生型植株中则ApTCP2转录水平更高;ApmTCP2和ApTCP2与miR319序列互补性低,将鸡爪槭ApTCP2和ApmTCP2分别在拟南芥野生型和jaw-d突变体植株中过表达后,jaw-d突变体中由miR319过表达引起的衰老抑制被解除,JA生物合成的相关基因表达增加,叶片出现了衰老现象。以上实验结果充分证实了miR319调控TCPs的机制在叶片衰老中发挥作用。

生长调节因子(growth-regulating factors,GRFs)是植物中特异性转录因子,与相互作用因子(GRF-interacting factors,GIFs)形成复合物,GRFs表达模式受miR396调控。拟南芥GRF3对miR396不敏感,GIF1表达水平增加叶片衰老延迟,miR396过表达可明显诱导衰老相关基因SEN1和SEN4的表达,miR396-GRF-GIF网络影响了叶片衰老进程[92]。植物中的miRNAs数量庞大,更多miRNAs在叶片衰老中的调控作用值得更深入的研究。

4.1.2 ta-siRNA参与调控植物叶片衰老反式小干扰RNAs(trans-acting small interfering RNAs,ta-siRNAs),是长度为21个核苷酸的内源性siRNA。ta-siRNAs的形成与miRNAs有关,ta-siRNAs由TAS基因产生,ta-siRNA基因座(TAS)从核基因转录,被含有RNA诱导沉默复合物(RNA-induced silencing complex,RISC)的Argonaute(AGO)识别并切割后与特定的miRNA结合,在RNA依赖型RNA聚合酶(RDR6)的作用下产生双链RNAs(dsRNAs),在被DCL蛋白裂解后生成ta-siRNAs[93]。ta-siRNAs和miRNAs一样通过靶向结合含有互补位点的mRNA调控基因的表达。目前已经在植物中鉴定出了4个编码ta-siRNAs的基因家族:TAS1、TAS2、TAS3和TAS4。其中TAS3可以被miRNA390靶向作用产生TAS3-ta-siRNA,而TAS3-ta-siRNA的靶基因包括生长素反应因子ARF2、ARF3和ARF4,可以引起相应基因的mRNA降解抑制其表达[94-95]。ta-siRNAs可以和miRNAs同时靶向调控同一基因家族的多个基因表达,在调控植物叶片衰老过程中与miRNAs有相互协调的作用[96]。

4.2 长链非编码RNA与叶片衰老调控

长链非编码RNAs(long non-coding RNAs,lncRNAs)是一类转录本长度大于200核苷酸的ncRNA,位于细胞核或细胞质中充当“核蛋白调节剂”[97-98],根据其在基因组中相对位置可分为正义lncRNAs(sense lncRNAs)、反义lncRNAs(antisense lncRNAs)、双向lncRNAs(bidirectional lncRNAs)、基因间lncRNAs(intergenic lncRNAs)和内含子lncRNAs(introic lncRNAs)5类[99]。此前对lncRNAs的研究主要集中在哺乳动物的生长发育、器官生长发育以及癌症相关研究等方面[100-102],发现lncRNAs能够通过顺式或反式作用模式调节蛋白质编码基因的表达[103]。近年来随着高通量测序技术快速发展,植物中lncRNAs的功能和作用机制也逐渐被探知,发现了lncRNAs在植物叶片衰老过程中的调控作用。Huang等[104]通过全基因组高通量测序,对水稻旗叶衰老过程中的lncRNAs进行了鉴定。在水稻从正常到衰老的5个发育阶段的旗叶中共鉴定出3 953个lncRNAs,其中与叶片衰老正负相关的差异表达lncRNAs分别为22个和48个。这些差异表达的lncRNAs靶向mRNA中,一部分编码了调控叶片衰老的转录因子,另一部分则编码衰老相关基因(SAGs)。表明了衰老相关的lncRNAs通过调控大量衰老相关mRNA转录在叶片衰老过程中发挥重要作用。Li等[105]在番茄叶片中鉴定出160个衰老过程中差异表达的lncRNAs,这些lncRNAs靶向调控的mRNAs大多富集在光合作用、转运蛋白等参与叶片衰老调控的通路上。此外研究发现了2个正向调控叶片衰老的lncRNA:MSTRG.16920和MSTRG.7613。通过病毒诱导使这2个lncRNA沉默,再经黑暗处理后,沉默番茄植株叶片较野生型植株叶片衰老延迟,衰老相关基因SlSAG12的表达也明显下调;他们还发现MSTRG.16920沉默植株中NAC转录因子Solyc02g069960、MSTRG.7613沉默的植株中过氧化物酶基因Solyc06g050440的表达水平都明显下降,表明了lncRNAs可能通过靶向调控转录因子和过氧化物酶基因的表达,调控植物叶片衰老。

lncRNAs还参与了RNA间相互作用的调控机制,Leonardo等[106]提出了竞争性内源RNAs(competing endogenous RNAs,ceRNAs)假说,mRNAs、lncRNAs和circRNAs作为ceRNAs竞争性的与miRNAs结合,降低miRNAs的抑制作用,上调靶基因的表达水平,构成了一个基因表达调控互作网络,lncRNA-miRNA-mRNA就是互作网络形式之一。lncRNA-miRNA-mRNA网络参与了植物叶片衰老的调控,Huang等[104]分析了调控水稻旗叶衰老的lncRNA-miRNA-mRNA网络,筛选出的差异表达的lncRNAs中,6个低表达的lncRNAs可能通过15个miRNAs调控51个共表达的mRNAs,14个高表达的lncRNAs可能通过21个miRNAs调控117个共表达的mRNAs;发现鉴定出的lncRNAMSTRG.62092.1能与miR164a和miR164e结合,提高编码转录因子NAC家族和MYB家族的mRNA的表达水平,证明了lncRNA-miRNA-mRNA网络调控水稻旗叶衰老。Sun等[107]通过对水稻早衰突变体的研究验证了lncRNA-miRNA-mRNA对叶片早衰的调控作用。利用转录组分析水稻ZJ正常表型植株和zj-es早衰突变体表型植株叶片基因表达情况,最终在差异表达的lncRNAs、miRNAs、mRNAs中共获得共表达的190对mRNA-lncRNA和3 391对mRNA-miRNA。通过对这些mRNAs进行功能分析,lncRNA-miRNA-mRNA网络与叶片早衰相关的多个分子代谢途径相关,也证实了lncRNAs作为ceRNAs调控网络的一部分,参与水稻zj-es突变体的衰老调控。

4.3 环状RNAs与叶片衰老调控

环状RNAs(circular RNAs,circRNAs)也是非编码RNA中的一类,是由前体mRNA经反向剪切得到呈封闭环状结构的RNA分子[108]。circRNAs最早在20世纪70年代就已经被发现,但当时只被认为是病毒的遗传物质[109]。circRNAs在动植物中广泛存在,具有较高的稳定性、进化保守性和组织特异性表达的特点,在高通量测序技术发展的支持下,越来越多的circRNAs及其功能被人们发现和研究,circRNAs具有miRNAs海绵、与RNA结合蛋白互作、翻译成蛋白质、调控转录和衍生出假基因等功能[110-112]。

circRNAs也是一种ceRNAs,通过circRNA-miRNA-mRNA网络调控植物叶片衰老[113]。Liu[114]研究了拟南芥生长和衰老过程中circRNA的功能。他们共鉴定出了168个circRNAs,分别有6个和35个circRNAs在G-M(生长-成熟)和M-S(成熟-衰老)阶段差异表达。通过对circRNA-miRNA-mRNA网络中的mRNAs功能分析,这些circRNAs靶向的mRANs与激素响应、胁迫相应等各种生物过程相关,说明circRNA-miRNA-mRNA网络通过参与不同的生物过程调控叶片衰老。基于拟南芥叶片转录组数据,Meng等[115]从中鉴定出了11 490个circRNAs,在对转录本的miRNA结合位点进行鉴定时,总共获得1 045个miRNA-circRNA结合位点,以及75个circRNAs相关共表达网络;在对鉴定出的拟南芥所有ceRNAs进行表达模式分析后,发现了1个包括25个circRNAs的ceRNAs聚类,随叶片衰老表达水平不断提高,也证明了circRNAs以ceRNAs的形式参与了叶片衰老的调控过程。另外,Huang等[116]验证了circRNAs调控水稻旗叶的衰老。他们在水稻旗叶5个发育时期的转录组数据中筛选出6 612个circRNAs,得到113个差异表达circRNAs。在对这113个差异表达circRNAs亲本基因进行基因功能注释后发现,其中部分亲本基因集中在“蛋白质水解”“叶绿体组织”“淀粉生物合成”等与叶片衰老相关的GO terms。通过WGCNA方法研究了差异表达circRNAs和差异表达mRNA的共表达网络,并进一步推断了circRNAs的潜在生物学功能。他们的研究发现circRNA:34、220472|34220、857mRNA的丰度与TALE转录因子BGIOSGA13510(Os03g0732100)的表达水平呈现出正相关关系,这表明该circRNA可能通过调节转录因子在叶片衰老中发挥重要作用。除此之外,差异表达的circRNAs的亲本基因还在蛋白质翻译后修饰、氧化还原过程以及活性氧信号通路与叶片衰老相关的生物过程中起作用,这表明circRNAs在多个方面参与了水稻叶片衰老调控。

5 展 望

植物衰老是植物生长发育的一个重要过程。植物叶片有多方面的利用价值,因此对调控叶片衰老的机制的研究,不仅能更加深入地了解植物衰老的调控机制,对于经济和生态方面也有重要意义。植物叶片衰老过程涉及了多个方面的动态调节,表观遗传调控对植物生长发育过程中基因表达水平的改变有重要的调控作用。近年来,组蛋白修饰、DNA甲基化、ATP依赖的染色质重塑以及ncRNAs介导的表观遗传修饰对叶片衰老的调控作用受到了广泛关注。本研究综述了表观遗传在植物叶片衰老过程中的调控作用,包括组蛋白修饰、DNA甲基化、ATP依赖的染色质重塑和ncRNAs参与叶片衰老调控的研究进展及作用机制。

越来越多的研究发现了衰老过程中DNA甲基化和组蛋白修饰程度调控SAGs的表达水平。目前组蛋白甲基化和乙酰化对植物叶片衰老的调控作用研究较为深入,但组蛋白泛素化和磷酸化参与植物叶片衰老调控的直接证据还有待进一步发掘。组蛋白修饰与DNA甲基化的调控因子相互作用,它们对组蛋白修饰和DNA甲基化的调控是否直接作用于调控植物叶片衰老还有待验证。染色质重塑通过共价和非共价方式实现,ATP依赖的染色质重塑复合物通过其他表观遗传方式间接调控植物叶片衰老的作用机制有待研究。此外,除了年龄依赖性衰老,黑暗等胁迫以及植物内源性激素也影响叶片的衰老,DNA甲基化和组蛋白修饰对不同方式诱导的叶片衰老的调控机制是否相同也是未来研究值得关注的问题。叶片衰老时叶片内营养物质的分解对农作物的经济价值有重要影响,因此经济作物叶片的早衰对农业有重要影响,目前组蛋白修饰和DNA甲基化调控叶片衰老的研究对象多是模式植物拟南芥,因此对植物中DNA甲基化和组蛋白修饰调控叶片衰老机制的保守性值得进一步探究。

另外,得益于组学技术的发展,人们发现了更多可能参与了植物叶片衰老的调控的ncRNAs种类,但只有miRNAs是目前研究得比较多也比较深入的一类与叶片衰老有关的ncRNAs,如miRNA164对叶片衰老的调控机理研究已相当深入,其他ncRNAs具体如何调控叶片衰老则知之甚少。其他ncRNAs,如lncRNAs和circRNAs,与叶片衰老的相关性大多是通过叶片衰老过程中ncRNAs的组学分析得到,有关它们具体的调控机理还需要进一步深入研究。ceRNAs竞争性机制作为一种RNA间相互作用机制调节着基因表达,对miRNA-lncRNA-circRNA-mRNA这一更复杂网络在叶片衰老中的调控作用也是值得研究的一方面。因此,多组学数据的联合分析仍然是未来解析ncRNAs有关叶片衰老调控网络的重要研究手段。总之,对不同的表观遗传修饰方式之间相关性、表观遗传修饰和衰老转录因子之间整体的网络研究的深入,有助于更加全面地了解植物叶片衰老的调控机制。