多穗金粟兰乙酸乙酯部分的抗氧化及抗炎活性研究

朱成光，武子敬，晏 晨

(1.贵州中医药大学，贵阳 550025；2.通化师范学院,通化 134002)

多穗金粟兰(Chloranthus multistachys S.J.Pei)为金粟兰科金粟兰属的多年本草植物，主产于我国贵州、湖南、四川等地[1,2]。民间又叫作四块瓦，全草入药，性味苦辛，微温，有小毒；具有舒筋活络、祛风止痛、清热解毒、消肿的功效[3]；可用于治疗风寒咳嗽、瘀血肿痛、毒蛇咬伤、疟疾、疮痈、跌打骨折、腰腿痛、疔肿、皮肤瘙痒等病症[1,2]。现代药理实验表明，金粟兰属植物多具有抗炎、抗菌、抗肿瘤、抗溃疡、镇痛，抗血小板聚集等活性[4-5]。本课题组成员已经完成对多穗金粟兰部分化学成分的分离，本文从体外抗氧化活性和抗炎消肿的角度对多穗金粟兰进行研究。

1 实验部分

1.1 仪器与材料

旋转蒸发仪（型号：0SB-2110，厂家：上海爱郎仪器有限公司）；予华牌循环水真空泵（型号：SHZ-DIII，厂家：巩义市予华仪器有限责任公司）；超声波清洗器（型号：SK5200H，厂家：上海科导超声仪器有限责任公司）；智能数显恒温水浴锅（型号：HH-S4，厂家：巩义市予华仪器有限责任公司）；足趾容积测量仪（型号：PV-200，厂家：成都泰盟科技有限公司）；全波长酶标仪（ReadMax 1200型）。DPPH、ABTS、Trolox（安徽酷尔生物工程有限公司）；化学实验所用试剂均为分析纯。

1.2 实验动物

由长春高新医学动物实验研究中心提供的雌性小鼠(合格证号：SCXK(辽)2015-0001)，体重20～22g。在恒温(22±2)℃的条件下；相对湿度(65±4)%。小鼠自由进食和饮水。

1.3 样品制备

称取多穗金粟兰200g，加入75%乙醇热回流提取，提取1h，连续提取2次，合并提取液，回收溶剂，待浓缩液无醇味，用乙酸乙酯进行萃取，萃取2次。对乙酸乙酯层进行浓缩，回收溶剂。萃取后的水层也进行浓缩。

1.4 抗氧化实验方法

1.4.1 DPPH自由基清除能力测定[6]

精确配制0.1mmol·L-1的DPPH乙醇溶液，于0～4℃避光保存，备用。分别取待测样品溶液2mL与DPPH溶液2mL均匀混合，在37℃恒温黑暗中反应30min，于517 nm波长处测定吸光度值，空白组以甲醇取代DPPH，对照以甲醇取代样品，以Trolox为阳性对照，每组平行测定3次。

DPPH自由基清除率(%)=(1—(Ai—Aj)/Ac)×100

式中：Ai为样品组吸光度；Aj为空白组吸光度；Ac为对照组吸光度。

1.4.2 ABTS自由基清除能力测定[7]

将7.0mmoL·L-1的ABTS溶液与2.45 mmoL·L-1过硫酸钾溶液等体积混合，室温避光静置12～16 h，即得ABTS自由基母液。用10 mmoL·L-1（pH7.4）磷酸缓冲溶液将ABTS自由基母液稀释。分别取待测样品溶液0.1 mL与3.9 mL ABTS自由基溶液中，振荡30s后室温静置10 min，于波长734 nm处测量吸光度值，空白组以甲醇取代DPPH，对照以甲醇取代样品，以Trolox为阳性对照，每组平行测定3次。

ABTS自由基清除率(%)=(1—(Ai—Aj)/Ac)×100

式中：Ai为样品组吸光度；Aj为空白组吸光度；Ac为对照组吸光度。

1.5 抗炎实验方法

1.5.1 分组及给药

将小鼠随机分为5组，每组7只，分别设多穗金粟兰乙酸乙酯萃取物高剂量组、剂量组、低剂量组、空白对照组（灌胃生理盐水）和阳性对照组（0.5%氢化可的松注射液)，多穗金粟兰乙酸乙酯萃取物高、中、低剂量组分别按0.4、0.2、0.1g·kg-1·d-1给药，各组均连续给药7天，灌胃量为0.1mL·10g-1。

1.5.2 抗炎实验[8,9]

连续给小鼠灌药7d，第7d末次给药前，先用足趾容积测量仪测每只小鼠右后足的原始足趾容积，然后对小鼠用1%角叉菜胶对右后足进行致炎，给药30min、60min后，分别测量致炎的足容积，并计算肿胀度。

肿胀度(%)=（致炎后的足趾容积－致炎前的足趾容积）/致炎前的足趾容积100%

1.5.3 统计学处理

实验数据均以×±s表示，应用SPSS10.0统计软件进行方差分析，实验结果记录整理见表2。各组间比较采用One-way ANOVA分析，以P＜0.05为数据具有统计学差异，P＜0.01为差异极显著。

表2 多穗金粟兰乙酸乙酯萃取的抗炎能力（n=7）

2 结果

2.1 多穗金粟兰乙酸乙酯萃取物的抗氧化能力

多穗金粟兰乙酸乙酯萃取物表现出一定的DPPH自由基和ABTS自由基清除能力，且与质量浓度成正相关，结果见表1。

表1 多穗金粟兰样品对自由基的清除能力IC50（μg·mL-1）

2.2 多穗金粟兰乙酸乙酯萃取物的抗炎能力

3 讨论

本实验首次对多穗金粟兰乙酸乙酯萃取物进行抗炎活性和抗氧化活性研究，在对多穗金粟兰乙酸乙酯层和水层进行抗氧化实验中发现，多穗金粟兰乙酸乙酯层对DPPH自由基的清除能力要强于水层；而对ABTS自由基的清除能力与水层的清除能力相当。在对多穗金粟兰乙酸乙酯层的抗炎实验中发现，在给药30min后，高中低三个不同给剂量组中，实验小鼠足趾肿胀程度与空白组无明显差异；而给药60min，高剂量组小鼠足趾肿胀度与空白组有显著性差异，中低剂量组小鼠足趾肿胀度与空白组无显著性差异。说明高剂量组对小鼠后足致炎肿胀有一定的抗炎消肿作用。

课题组后续还将继续对多穗金粟兰乙酸乙酯层的化学成分进行分离纯化，并进行体内抗氧化研究，进一步探讨多穗金粟兰乙酸乙酯层抗氧化的物质基础及其作用机制。