基于网络药理学的人参、红参、黑参、人参叶、西洋参和三七抗心力衰竭的作用机制及活性成分研究

黄 也，窦德强

（辽宁中医药大学药学院·辽宁 大连·116600）

心力衰竭（heart failure）是各种心血管疾病的终末阶段，是最重要的心血管疾病之一。心力衰竭患病率随着患者年龄增长而上升，70岁以上发病率可达10%[1]，预后较差，临床数据表明患者患病30天、1年和5年后的死亡率分别为10.4%、22%和42.3%[2]，与恶性肿瘤相比死亡率较高。现代医学认为心力衰竭是一组由心脏结构和（或）功能异常引起的临床综合征，主要表现为呼吸困难、疲乏和肢体浮肿等，且与多种非心血管疾病如慢性支气管炎、慢性阻塞性肺疾病（COPD）、痛风、慢性肾病等密切相关[3]。根据其临床表现，心力衰竭在中医药理论中主要分属于胸痹、心悸、水肿、喘证等范畴，基本证候特征为心气虚证[4]。中医治疗心衰常以补益心气为主[5]，补气类中药人参、人参叶、西洋参、三七及人参炮制品红参、黑参广泛用于心衰疾病的治疗，可缓解心气虚症状，改善心功能，且毒副作用较小。

虽然中药治疗心力衰竭的疗效已有许多研究，但由于中药具有“多成分、多途径、多靶点”的特点，且炮制后的化学成分种类及含量发生了显著变化，其发挥药效的关键成分和作用靶点、机制尚不清楚。网络药理学基于传统药理学、生物网络学、计算生物学、网络分析等学科，系统地揭示药物、疾病靶点和生物信号通路之间的相互作用关系[6]，已被广泛应用于研究中药活性成分、预测作用靶点及作用机制等方面。本研究基于网络药理学方法研究人参、人参叶、红参、黑参、西洋参、三七治疗心力衰竭的物质基础和作用机制，为进一步研究提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 数据库及数据来源

中医药整合药理学研究平台v2.0（Integrative Pharmacology-based Research Platform of Traditional Chinese Medicine，TCMIP）；PubChem数据库（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）；Swiss Target Prediction数据 库 (http://www. swisstargetprediction. ch/）；GeneCards数据库(https://www.genecards.org/)；人类孟德尔遗传（OMIM）数据库（http://www.omim.org/）；Therapeutic Target Database（TTD）数据库（http://db.idrblab.net/ttd/）；Drugbank数据库（https://go.drugbank.com/）；STRING数据库（https://string-db.org/）；Metascape数据库（http://metascape.org/）；Venny2.1在线软件作图工具平台 (https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)；CytoScape3.7.1软件。

1.2 药物活性成分筛选及其靶点获取

结合文献调研和实验室前期研究成果，利用TCMIP v2.0中药材数据库，以“人参”、“红参”、“人参叶”、“西洋参”、“三七”为关键词检索获得药物的化学成分以及所对应的靶点信息，选择相似性分数≥0.8的药物所对应的靶标作为候选靶点。经过文献调研选取黑参的活性成分，在TCMIP v2.0中药成分数据库中获得所对应的靶点信息。利用PubChem数据库对化合物信息进行名称的矫正和统一，并上传到Swiss Target Prediction数据库，靶点种类设定为“Homo sapiens”，将靶点概率值（Probability）≥0的分子作为该成分有效靶点，对药物的靶点信息进行补充。

1.3 疾病靶点及交集靶点获取

通过GeneCards、OMIM、TTD、Drugbank数据库，以“heart failure”作为关键词检索收集与心力衰竭相关的靶点。将结果进行汇总并剔除重复项，得到HF潜在靶点。将筛选过的靶点上传至在线韦恩图，得到药物与HF的交集基因。

1.4 “药物-成分-疾病-靶点”网络构建

使用CytoScape3.8.0软件,构建“药物-成分-疾病-靶点”相互作用网络图，使用Network Analyzer功能对中药主要活性成分进行分析。

1.5 蛋白相互作用（PPI）网络构建及核心靶点分析

将上述交集基因导入String数据库构建蛋白质之间的PPI，将PPI网络导入CytoScape3.8.0软件进行调整构建并分析交互网络，利用cytoHubba插件得到关键靶点并根据蛋白之间的关联度进行排序。

1.6 KEGG通路和GO功能富集分析

基因本体论（GO）数据库可用于分析潜在的生物分子机制，进一步解释交集基因在分子功能、生物过程和细胞组成抗HF的过程。京都基因与基因组百科全书（KEGG），KEGG富集分析可用于研究交集基因涉及的主要抗HF信号通路。本研究利用Metascape数据库（http://metascape.org/）对PPI网络中筛选出的核心靶点进行GO功能注释和KEGG通路分析，将富集分析结果可视化。同时构建“药物-主要通路-心力衰竭”核心靶点网络。

1.7 药性归属靶点信息

人参为五加科植物人参Panax ginseng C.A.Mey.的干燥根和根茎，性微温。红参为五加科植物人参Panax ginseng C.A.Mey.的栽培品经蒸制后的干燥根和根茎，性温。黑参为五加科植物人参Panax ginseng C.A.Mey.的栽培品经多次蒸晒（多九蒸九晒）的干燥根和根茎，性温。西洋参为五加科植物西洋参Panax quinquefolium L.的干燥根，性凉。人参叶为五加科植物人参Panax ginseng C.A.Mey.的干燥叶，性寒。三七为五加科植物三七Panax notoginseng（Burk.）F.H.Chen的干燥根和根茎，性温[7]。

将药性寒、凉、微温、温依次赋值为-2、-1、0.5、1，与药物成分、靶点、通路的degree加权。通过对比去重的方法剔除寒凉、温性中药共同涉及的治疗HF的成分、靶点、代谢通路，得到寒凉性中药和温性中药的特异性代谢通路。

2 结果

2.1 化学成分及对应的靶点分析

通过TCMIP v2.0检测人参、红参、人参叶、西洋参和三七的化学成分以及所对应的靶点信息，利用PubChem数据库对化合物信息进行名称的矫正和统一，并上传到Swiss Target Prediction数据库，靶点种类设定为“Homo sapiens”，将靶点概率值（Probability）≥0的分子作为该成分有效靶点，对药物的靶点信息进行补充。去除结构未知及靶点与疾病不相关的成分，并结合文献和实验室前期研究进行筛选及补充，分别得到人参活性成分64个及靶点615个、红参活性成分30个及靶点359个、人参叶活性成分27个及靶点195个、西洋参活性成分26个及靶点257个和三七活性成分40个及靶点296个。经文献调研[8～10]和实验室前期研究选取黑参的活性成分，在TCMIPv2.0中药成分数据库并经上述条件筛选后获得所对应的靶点信息，得到黑参活性成分15个及靶点399个。各药物靶点数目前10名的成分信息，详见表1。

表1 各药物成分及靶点信息

2.2 药物-疾病共同靶点的获取

在GeneCards、OMIM、TTD、Drugbank数 据 库 以“heart failure”作为关键词检索，分别筛选出13391、140、75、74个HF相关基因，选取相关性数值（Relevance score）＞10作为筛选条件剔除相关性得分较小的基因，将结果合并剔除重复基因，共得到1286个高分靶点。在Venny2.1工具平台上将得到的HF高分靶点分别与人参、红参、黑参、人参叶、西洋参和三七素潜在靶点信息取交集，得到各药物治疗心力衰竭潜在靶点为157、108、96、80、93、106个。

2.3 药物-成分-靶点-疾病网络图的构建

将人参、红参、黑参、人参叶、西洋参和三七素的潜在活性成分与药物-疾病共同靶点点输入Cytoscape软件中，绘制出“药物-成分-靶点-疾病”相互作用的网络图。结果见图1～6。图中胡各色三角代表药物，蓝色方块代表各药物的活性成分，红色圆圈代表 包 括MAPK1、STAT3、VEGFA、AKT1、TNF、EGFR在内的共同靶点，绿色菱形代表疾病。各药物治疗HF活性成分的Degree值前10名的成分，详见表2。

表2 各药物治疗HF有效成分Degree值

图1 人参药物-成分-靶点-疾病网络图

图2 红参药物-成分-靶点-疾病网络图

图3 黑参药物-成分-靶点-疾病网络图

图4 人参叶药物-成分-靶点-疾病网络图

图5 西洋参药物-成分-靶点-疾病网络图

图6 三七药物-成分-靶点-疾病网络图

根据各有效成分的Degree值可以推测原人参三醇、Ginsenoside Rh3、Ginsenoside Rh4、山奈酚、谷甾醇及有机酸类化合物可能为治疗HF的活性成分，黑参中稀有皂苷Rk3、Rg5也有较强活性。

2.4 PPI网络及治疗HF的关键靶点

在STRING数据库中录入上述各药物与疾病的交集靶点，物种限定为人“Homo sapiens”，得到蛋白互作网络，将其进一步导入Cytoscape软件进行可视化分析。利用Analyze Network及cytoNCA插件计算介数 中 心 性 （Betweenness centrality）、接 近 中 心 性（Closeness centrality）、点度中心性（degree centrality）、特征向量（Eigenvector）、局部平均连通性（Local Average Connenctivity-based mathod）、网络中心度（Network centrality），综合得到Degree排名各药物前10治疗HF的关键靶点。

结果显示，人参PPI网络中剔除与其他蛋白没有相互作用关系的GAA后，发现有58个节点的度值大平均值（degree=23.5），占总节点数的37.2%，其中度值最高的为AKT1（degree=89）。红参PPI网络中剔除与其他蛋白没有相互作用关系的LIMK1、KCNA5后，发现有41个节点的度值大平均值（degree=16.9），占总节点数的38.7%，其中度值最高的为AKT1（degree=67）。黑参PPI网络中发现有38个节点的度值大平均值（degree=15.7），占总节点数的39.6%，其中度值最高的为AKT1（degree=57）。人参叶PPI网络中剔除与其他蛋白没有相互作用关系的LIMK1后，发现有37个节点的度值大平均值（degree=17.3），占总节点数的40.2%，其中度值最高的为AKT1（degree=62）。西洋参PPI网络中剔除与其他蛋白没有相互作用关系的LIMK1后，发现有37个节点的度值大平均值（degree=16.9），占总节点数的40.7%，其中度值最高的为AKT1（degree=60）。三七PPI网络中发现有45个节点的度值大平均值 （degree=18.8），占总节点数的43.4%，其中度值最高的为AKT1（degree=66）。其中AKT1、CASP3、STAT3、TNF、VEGFA、EGFR在6种 药物的PPI网络中中都具有很高Degree排名，可能为人参、红参、黑参、人参叶、西洋参和三七治疗HF的关键靶点。详见图7～12、表3。

表3 各药物治疗HF靶点Degree值

图7 人参核心PPI网络

图8 红参核心PPI网络

图9 黑参核心PPI网络

图10 人参叶参核心PPI网络

图11 西洋参核心PPI网络

图12 三七核心PPI网络

2.5 GO富集分析

在Metascape数据库对人参、红参、黑参、人参叶、西洋参和三七治疗HF的关键靶点进行生物过程（BP）、细胞组成（CC）、分子功能（MF）3方面的GO功能富集分析。结果显示6种药物治疗HF的生物过程主要集中在：炎症反应的调节、细胞凋亡信号通路的调节、血液循环过程、对激素水平的调节、蛋白质磷酸化的调节、心脏收缩的负调节、细胞迁移的积极调节；分子功能生物过程主要集中在：蛋白激酶活性、脂质结合、核受体活性、ATP酶结合、跨膜受体蛋白激酶活性、核受体活性、生长因子受体结合；细胞组成主要集中在：膜筏、膜微域、质膜蛋白复合物、神经肌肉接头、突触前膜、囊泡腔。

2.6 KEGG富集分析

将人参、红参、黑参、人参叶、西洋参和三七治疗HF的关键靶点蛋白导入Metascape数据库进行KEGG通路注释分析，分别富集出157、108、96、80、93、175条信号通路。其中前30是最具有显著性的通路，将结果进行可视化其中P值代表富集的显著性，颜色越红则显著性越高，点的大小对应于条目中注释的基因数，详情见图13～18。其中Pathways in cancer为癌症相关的通路，包括与维持血管生成相关的VEGF signaling pathway、HIF-1 signaling pathway；与细胞凋亡相关的PI3K-Akt signaling pathway、mTOR signaling pathway；与增殖相关的MAPK signaling pathway等。

图13 人参KEGG通路富集分析结果图

其中癌症中的蛋白多糖（Proteoglycans in cancer）、EGFR酪氨酸激酶抑制剂耐药性通路（EGFR tyrosine kinase inhibitor resistance）、PI3K-AKT信号通路 （PI3K-Akt signaling pathway）、糖尿 病 并 发 症AGE-RAGE信号通路（AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications）、脂质与动脉粥样硬化通路（Lipid and atherosclerosis）、MAPK信 号 通 路 通 路（MAPK signaling pathway）、HIF-1信号通路（HIF-1 signaling pathway）、VEGF信号通路（VEGF signaling pathway）、肿瘤坏死因子信号通路 （TNF signaling pathway）在6种药物的KEGG分析结果中都具有很高的富集显著性，可能为人参、红参、黑参、人参叶、西洋参和三七治疗HF的关键通路。

14红参KEGG通路富集分析结果

图15 黑参KEGG通路富集分析结果

图16 人参叶KEGG通路富集分析结果

图17 西洋参KEGG通路富集分析结果图

18三七KEGG通路富集分析结果

2.7 药性归属靶点分析

2.7.1 各成分药性归属分析

将药性寒、凉、微温、温依次赋值为-2、-1、0.5、1，对比剔除寒热药治疗HF相同成分后到寒热特异性成分并与degree加权，归属排序各药性所包含的成分，共得到温热性药物治疗HF成分82个，寒凉性药物治疗HF成分20个，详见表4。

表4 各药治疗HF成分信息表

2.7.2 靶点药性归属分析

将药性寒、凉、微温、温依次赋值为-2、-1、0.5、1，剔除寒热药治疗HF共有靶点后得到寒热特异性靶点并与degree加权，归属排序各药性所包含的靶点，共得到温热性药物治疗HF靶点70个，寒凉性药物治疗HF靶点10个，详见表5。

表5 各药物治疗HF靶点信息表

将药性寒、凉、微温、温依次赋值为-2、-1、0.5、1，与所有通路degree加权，通过对比去重的方法剔除寒凉、温性中药共同涉及的治疗HF的代谢通路，得到寒凉性中药和温性中药的特异性代谢通路并与Gene Ratio（%）加权。共得到温热性药物治疗HF通路32个，寒凉性药物治疗HF靶点15个，详见表6。

表6 各药物治疗HF通路信息表

温热性药治疗HF特异性成分可能为原人参三醇 、Ginsenoside Rh3、Ginsenoside Rh4、Ginsenoside Rg5、Ginsenoside Rk2；特异性靶点可能为CDK8、AGTR1、GYS1、MMP1、TRPV4；特异性通路可能为脂质与动脉粥样硬化通路（Lipid and atherosclerosis）、乙型 肝 炎 通 路 （Hepatitis B）、mTOR通 路（mTOR signaling pathway）、中枢碳代谢通路（Central carbon metabolism in cance r）、IL-17通路 （IL-17 signaling pathway）。

寒性药治疗HF特异性成分可能为，Ginsenoside Rh6、 异 丁 香 酚 （Isoeugenol）、Ginsenoside Rh7、Ginsenoside Rh8、硬脂酸（Stearic Acid）；特异性靶点可 能 为CYP1A2、EPAS1、ATP1A3、ATP1A2、ELANE特异性通路可能为受体激活通路（Chemical carcinogenesis-receptor activation）、甲状腺激素信号通路（Thyroid hormone signaling pathway）、松弛素信号通路 （Relaxin signaling pathway）、PD-L1表达和PD-1检查点通路 （PD-L1 expression and PD-1 checkpoint pathway in cancer）、小细胞肺癌相关通路（Small cell lung cancer）。

3 结论

心力衰竭中医药理论中主要分属于胸痹、心悸、水肿、喘证等范畴。患者的主要证候要常以心脉淤阻、气滞心胸、寒凝血脉、痰瘀互结、气阴两虚等为主。其中气虚证与血瘀证是心力衰竭最为常见的证型。益气活血类中药人参、人参叶、西洋参、三七及人参炮制品红参、黑参广泛用于心衰疾病的治疗，可缓解心气虚症状，改善心功能[11～15]。有研究表明，复方人参补气颗粒可抑制心肌纤维化、改善心室重构、抑制炎症从而改善急性心梗后心衰大鼠的心肌损伤情况[16]。人参皂苷Rg1可改善冠状动脉左前降支结扎诱导的心衰大鼠的心功能，抑制心肌细胞细胞膜损伤，改善心衰心肌细胞动作电位，且呈剂量依赖性[17]。临床调查研究显示，小剂量西洋参联合常规利尿剂、扩血管药给药可有效改善充血性心力衰竭患者心功能[18]。西洋参提取物可减轻特非那定所致心脏损伤模型斑马鱼的心包水肿和卵黄囊下瘀血、恢复血流速度、提高心律，心脏损伤相对修复率为75.48%～98.12%，具有一定的心脏保护作用[19]。三七皂苷R1可上调表达抗氧化AMPK/Nrf-2/HO-1通路、抑制心肌细胞凋亡、氧化应激、炎症反应，从而改善冠心病大鼠心肌损伤[20]。

本研究筛选出人参、红参、黑参、人参叶、西洋参和三七的有效活性成分、作用靶点、信号通路，构建与心力衰竭相关的PPI网络，以分析治疗心力衰竭的潜在作用机制。其中原人参三醇、Ginsenoside Rh3、Ginsenoside Rh4、山奈酚、谷甾醇及有机酸类化合物可能为治疗HF的活性成分；AKT1、CASP3、STAT3、TNF、VEGFA、EGFR等靶点可能为治疗HF的关键靶点；癌症中的蛋白多糖 （Proteoglycans in cancer）、EGFR酪氨酸激酶抑制剂耐药性通路（EGFR tyrosine kinase inhibitor resistance）、PI3K-AKT信 号 通 路（PI3K-Akt signaling pathway）、糖尿病并发症AGERAGE信号通路（AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications）、脂质与动脉粥样硬化通路（Lipid and atherosclerosis）等信号通路可能是治疗HF的重要信号通路。通过各药物成分、靶点、通路赋值得到温热性药物治疗心力衰竭的主要成分为原人参三醇、人参皂苷Rh3等，主要靶点为CDK8、AGTR1、GYS1、MMP1等，主要通路为脂质与动脉粥样硬化通路；寒性药物治疗心力衰竭的主要成分为人参皂苷Rh6等，主 要 靶 点 为CYP1A2、EPAS1、ATP1A3、ATP1A等，主要通路为受体活化通路。

在“药物-成分-靶点-疾病网络”及富集分析中可以发现，药物的每种活性成分对应于多个靶点，每个靶点都与多种成分相关，体现药物多成分和多靶点治疗心力衰竭的作用机理；同一靶点将多个途径连接起来，与多个活性成分发挥协同作用，体现中药治疗的“多成分、多途径、多靶点”的特点。不同药性的药物治疗心力衰竭的成分、靶点和信号通路有一定的差异性，在治疗中可以选择性用药，为后续研究中药传统功效提供了新的思路与基础。