辛芍组方对缺血/再灌注损伤的神经细胞炎症反应和氧化应激的影响

齐琳 甄巧霞 刘翠 刘爱贤

(首都医科大学附属北京康复医院神经康复中心，北京 100144)

脑缺血/再灌注损伤是脑血管疾病之一，将会导致局部脑组织及其功能的损害，短期不完全性缺血只引起可逆性损害，而长时间的完全缺血或严重缺血会引起梗死〔1，2〕。脑缺血时脑细胞生物电发生改变，出现病理性慢波，缺血一定时间后再灌注，慢波持续并加重。颞叶组织内神经递质性氨基酸代谢发生明显变化，即兴奋性氨基酸随缺血/再灌注时间延长而逐渐降低，抑制性氨基酸在缺血/再灌注早期明显升高。缺血/再灌注损伤时间越长，脑组织超微结构改变越明显，呈现不可逆损伤〔3，4〕。辛芍组方由灯盏细辛和赤芍配伍组成，菊科植物灯盏细辛和毛茛科植物赤芍均为传统的活血化瘀类中药，两者进行组方配制为辛芍组方〔5～7〕。但其辛芍组方对脑缺血再灌注损伤的作用及其机制尚不明确。本实验讨论辛芍组方对缺血/再灌注损伤的神经细胞炎症反应和氧化应激的影响。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1药物和细胞 辛芍组方(贵州省药物制剂重点实验室)；小鼠海马神经元HT22细胞(中科院上海细胞库)。

1.1.2试剂 胎牛血清、高糖和无糖DMEM培养基、青霉素链霉素混合液(美国Cell Signaling Technology公司)；0.25%胰蛋白酶EDTA溶液(美国Gibco公司)；细胞计数(CCK)-8试剂盒(南京赛泓瑞生物科技有限公司)；肿瘤坏死因子(TNF)-α、白细胞介素(IL)-6、IL-1β酶联免疫试剂盒(上海碧云天生物科技有限公司)；活性氧(ROS)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)检测试剂盒(上海酶联生物技术有限公司)；二喹啉甲酸(BCA)蛋白检测试剂盒(美国Sigma公司)；一抗和辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗兔二抗(美国Abcam公司)；自噬体荧光染料(美国Enzo Life Sciences公司)。

1.1.3仪器 电子分析天平〔陆冠森生物科技(上海)有限公司〕；台式低速、高速冷冻离心机(美国Thermo Fisher Scientific公司)；高压灭菌器(日本三洋电器股份有限公司)；电热恒温培养箱(深圳市爱特尔电子科技有限公司)。

1.2方法

1.2.1细胞培养 小鼠海马神经元HT22细胞用含10%胎牛血清和含1%青霉素链霉素混合液的高糖DMEM培养基，在37℃、5%CO2细胞恒温培养箱中培养，24 h后更换培养基继续培养细胞。待细胞生长至80%～90%时进行传代，0.25%胰蛋白酶EDTA溶液消化细胞，用胰酶终止消化，取传代细胞进行后续实验。

1.2.2氧糖剥夺/再灌注(OGD/R)模型建立 去除细胞培养皿中的完全培养基，磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤2次，去除残存成分，加入不含血清、不含抗生素的无糖DMEM培养基，在37℃、5%CO2的细胞培养箱中进行OGD 8 h。OGD结束后，将无糖DMEM培养基替换为完全培养基，在正常条件下培养24 h。

1.2.3细胞分组 建立小鼠海马神经元HT22细胞OGD/R模型，进行细胞培养，不进行其他处理的作为模型对照(Con)组；使用不同浓度(0.31、0.62、1.25 mg/L)的辛芍组方处理建模后的HT22细胞，作为0.31 mg/L组、0.62 mg/L组、1.25 mg/L组；正常培养的HT22细胞作为正常(Normal)组，每组9只。

1.2.4CCK-8检测细胞活性 各组HT22细胞以1×105个/孔接种细胞于96孔板，培养24 h后每孔加入10 μl CCK-8试剂，继续培养2 h，通过酶标仪检测490 nm处吸光度值(OD)。以OD值代表细胞活性。

1.2.5酶联免疫吸附试验(ELISA)检测TNF-α、IL-6、IL-1β炎症因子水平 收集各组HT22细胞上清液，-20℃保留备用。严格按照TNF-α、IL-6、IL-1β试剂盒说明书的试验步骤，检测上清液中各指标水平。

1.2.6试剂盒检测过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)氧化应激指标含量 收集各组HT22细胞，-20℃保留备用。依照CAT、SOD、MDA检测试剂盒说明书检测各氧化应激指标。

1.2.7Western印迹检测微管相关蛋白1轻链3-Ⅱ(LC3Ⅱ)、自噬相关蛋白(P62)、低氧诱导因子(HIF)-1α 蛋白表达 收集各组HT22细胞，加入RIPA裂解液，冰上裂解30 min，提取细胞总蛋白。采用BCA法检测蛋白浓度，蛋白样品中加入十二烷基硫酸钠(SDS)上样缓冲液，沸水煮10 min，蛋白变性。采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)分离蛋白，将分离的蛋白凝胶转移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，封闭，孵育一抗稀释液(1∶1 000)，4℃孵育24 h，TBST洗涤，孵育二抗稀释液(1∶2 000)，室温孵育1 h，TBST洗涤，滴加化学发光底物(ECL)，暗室内曝光显影，应用ImageJ软件分析各条带灰度值。

1.2.8荧光显微镜检测细胞中自噬体数量 收集各组HT22细胞，PBS洗涤2次，加入5%胎牛血清预混的和PBS稀释的自噬体荧光染料(Green Detection浆染试剂稀释至1∶500，Hoechst33342核染试剂稀释至1∶1 000)，37℃避光孵育30 min，PBS洗涤2次，使用荧光显微镜检测细胞自噬体数量。

1.3统计学分析 采用SPSS22.0软件进行方差分析，两两比较采用SNK-q检验。

2 结 果

2.1辛芍组方对缺血/再灌注损伤的神经细胞活性的影响 与Normal组比较，Con组细胞OD值显著降低(P<0.05)；与Con组比较，0.31、0.62、1.25 mg/L辛芍组方组细胞OD值显著升高，且呈剂量依赖性(P<0.05)。见表1。

2.2辛芍组方对缺血/再灌注损伤的神经细胞炎症反应的影响 与Normal组比较，Con组细胞TNF-α、IL-6、IL-1β水平显著升高(P<0.05)；与Con组比较，0.31、0.62、1.25 mg/L辛芍组方组细胞TNF-α、IL-6、IL-1β水平显著降低，且呈剂量依赖性(P<0.05)。见表1。

2.3辛芍组方对缺血/再灌注损伤的神经细胞氧化应激的影响 与Normal组比较，Con组细胞MDA含量显著升高，CAT、SOD活性显著降低(P<0.05)；与Con组比较，0.31、0.62、1.25 mg/L辛芍组方组细胞MDA含量显著降低，CAT、SOD活性显著升高，且呈剂量依赖性(P<0.05)。见表1。

2.4辛芍组方对缺血/再灌注损伤的神经细胞自噬的活化的影响 与Normal组比较，Con组细胞LC3Ⅱ蛋白表达和自噬小体数量显著升高，P62蛋白表达显著降低(P<0.05)；与Con组比较，0.31、0.62、1.25 mg/L辛芍组方组LC3Ⅱ蛋白表达和自噬小体数量显著降低，P62蛋白表达显著升高，且呈剂量依赖性(P<0.05)。见图1、表2。

2.5辛芍组方对缺血/再灌注损伤的神经细胞HIF-1α蛋白的影响 与Normal组(1.00±0.10)比较，Con组HIF-1α蛋白表达显著升高(1.53±0.12，P<0.05)；与Con组比较，0.31、0.62、1.25 mg/L辛芍组方组HIF-1α蛋白(0.86±0.08、0.55±0.05、0.39±0.03)显著降低，且呈剂量依赖性(P<0.05)。见图2。

表1 辛芍组方对缺血/再灌注损伤的神经细胞活性、炎症反应、氧化应激的影响

1～5：Normal组、Con组、0.31 mg/L辛芍组方组、0.62 mg/L辛芍组方组、1.25 mg/L辛芍组方组，下图同图1 Western印迹检测LC3Ⅱ、P62蛋白表达

表2 辛芍组方对缺血/再灌注损伤的神经细胞自噬的 活化的影响

图2 Western印迹检测HIF-1α 蛋白表达

3 讨 论

在脑缺血再灌注损伤过程中，神经元细胞自噬持续在较高水平，多种自噬相关蛋白参与其中，且高水平的自噬与神经元细胞凋亡和死亡水平密切相关〔8，9〕。HIF-1α广泛参与细胞的多种应激反应，HIF-1α在正常脑组织中低表达，而当大脑发生缺血缺氧时，HIF-1α表达明显增高，促进神经元细胞凋亡〔10，11〕。

本研究说明，辛芍组方提高了细胞的活性。刘宗炎〔12〕研究表明，辛芍组方能不同程度地提高细胞存活率。刘亭等〔13〕研究表明，辛芍组方抗对脑缺血再灌注损伤具有抗氧化、抗凋亡的作用。

本研究结果说明，辛芍组方抑制了缺血/再灌注损伤的神经细胞炎症水平和氧化应激。刘亭等〔13〕研究表明，辛芍组方对缺血再灌注损伤后的细胞具有保护作用，与减轻细胞内氧化应激有密切联系。董永喜等〔14〕研究发现，辛芍组方中灯盏细辛，赤芍单方对脑缺血再灌注损伤大鼠的炎症水平和氧化应激具有抑制作用。

本研究结果说明，辛芍组方抑制了缺血/再灌注损伤的神经细胞自噬活化。已有研究〔15〕与本实验结果类似。侯杨〔16〕研究表明，中药姜黄素抑制了缺血/再灌注损伤的神经细胞自噬的活化和降低了HIF-1α蛋白表达水平，对神经起到了保护的作用。