血浆循环游离DNA 含量及完整性在乳腺癌中的临床价值

樊丽壮，王博，徐爱兰，刘艳佳

（佳木斯大学附属第一医院肿瘤科，黑龙江 佳木斯 154000）

乳腺癌（breast cancer）是发病率最高的癌症，也是癌症死亡的主要原因[1]。研究显示[2，3]，转移性乳腺癌的生存率下降至25%以下，早期诊断可以降低20%的死亡率。循环游离DNA（circulating cell-free DNA，cf-DNA）是一种血液或体液中游离于细胞之外的DNA[4]。cf-DNA 检测属于液体活检的一种，对于诊断原发性肿瘤或难以提取样本的组织转移性病变的阶段，可以提供可靠的替代方案[5]；同时也可以与乳房X 线检查相结合作为一种有价值的临床实践工具，从而更好地筛选出适合活检或随访乳腺癌候选者。近年来，随着基因组测序自动化，基因芯片技术日趋成熟，利用分子生物学技术作为乳腺癌的辅助诊断成为一种趋势[6]。研究表明[7]，基因和分子生物标记物进行分类有助于预测单个肿瘤的病程，是肿瘤下一步采取治疗的方法。目前，cf-DNA 在临床应用价值已得到证实[8-10]。但受初始样本、提取及检测方法、仪器灵敏度、实验操作等多方面的影响，cf-DNA 含量及完整性检测结果各有不同，对临床使用价值的判定也不同。本研究通过检测乳腺癌患者外周血液中cf-DNA Alu 序列长、短片段（241 bp、100 bp）含量及cf-DNA 完整性（Alu 241/100），探讨循环游离DNA 在乳腺癌辅助诊断中的临床价值，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集2020 年9 月-2021 年7 月佳木斯大学附属第一医院收治的女性乳腺癌患者血液样本56 例作为病例组，年龄35～75岁，平均年龄55岁；合并淋巴结转移39 例、无淋巴结转移17 例。纳入标准：①经影像学及病理组织学穿刺活检确诊为乳腺癌患者；②临床资料齐全且自愿入组；③无其他肿瘤病史；④术前均未接受放化疗、内分泌治疗及靶向治疗。排除标准：①合并其它系统疾病或者恶性肿瘤者；②妊娠期或哺乳期者；③临床资料不完整者。同时收集佳木斯大学附属第一医院体检中心体检健康者20 名的血液样本作为对照组,均为女性，年龄25～65岁，平均年龄45 岁。两组年龄比较，差异无统计学意义（P＞0.05），可对比。本研究通过医院伦理委员会审批，所有研究对象均知情同意并签署知情同意书。

1.2 主要仪器和试剂 超低温冰箱（Thermo Fisher Scientific，美国），Qubit 4 Fluoromete（Thermo Fisher Scientific，美国），离心机（Thermo Fisher Scientific，美国），PCR 仪（Thermo Fisher Scientific，美国），实时荧光定量PCR 仪（Thermo Fisher Scientific，美国）,High Pure PCR Template Preparation Kit（Roch，中国），Qubit dsDNAHS Assay Kit（Invitrogen，美国）,探针引物（睿博兴科生物技术有限公司，中国）。

1.3 方法

1.3.1 标本采集和DNA 提取 用柠檬酸钠（1∶9）蓝色真空采血管在手术前一天早晨7∶30 空腹收集10 ml 肘正中静脉血液，室温静置30 min后，4 ℃3000 r/min离心10 min 粗离血浆；取上清血浆至1.5 ml 灭菌洁净离心管中，4 ℃8000 r/min 第2 次离心15 min 获得无血细胞成分的纯血浆。用1.5 ml 灭菌洁净离心管分装（每管200 μl），采用High Pure PCR Template Preparation Kit，按照试剂盒说明书进行操作提取DNA，放置于-80 ℃备用。采用Qubit dsDNAHS Assay Kit 对DNA 进行浓度测定，同时采用Qubit 4 Fluoromete 测定吸光度（A260/280）值，取比值为1.6～1.8的DNA 样本，提取的DNA-20 ℃保存。为保证试验精确性，均采用同一批号的试剂盒提取所有血浆标本。

1.3.2 血浆循环游离DNA 完整性的检测 引物序列由睿博兴科生物技术有限公司合成，PCR 引物序列及循环参数[11]见表1。引物按照说明书操作完成，配置成10 μmol/ml 的溶液于-20 ℃保存。

表1 PCR 引物序列及循环参数表

1.3.3 配置标准品 用T-A 克隆技术，构建不同hTERT DNA 片段的质粒及内参β-actin 的质粒，提取质粒DNA，测其浓度并换算成拷贝数，10 倍梯度稀释后作为标准品。每个标本检测3 次后再取平均值。根据扩增后得到的Ct 值绘制标准曲线。

1.3.4 荧光定量PCR 体系 按照表2 进行配制体系，于冰上或冰盒中添加至qPCR 专用96 孔板中。

表2 配置PCR 反应体系表

1.3.5 PCR 循环参数 95 ℃预变性5 min；95 ℃变性10 s，55 ℃退火20 s，72 ℃延伸31 s，40 个循环扩增；最后72 ℃延伸31 s 结束反应，溶解曲线阶段仪器默认设置。为评估血浆DNA 含量及完整性指数，对乳腺癌的cf-DNA 分别扩增其基于β-actin 和基因hTERT 长、短片段质粒标准品的扩增曲线，并以长、短片段扩增产物比值作为DNA 完整性指标。

1.4 统计学方法 采用GraphPad Prism 8 版软件对所有实验数据cf-DNA 分析和检验、作图。计量资料用[M（P25，P75）]表示，组间比较采用秩和检验。使用受试者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲线来评估血浆循环游离DNA 在乳腺癌诊断上的作用。使用Fisher 精准检验分析乳腺癌患者临床病理参数与cf-DNA 完整性的关系。双侧P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组长、短片段血浆cf-DNA 含量比较 长片段241 bp 在病例组和对照组血浆中表达水平分别为[7.57（5.07，10.97）]和[3.72（1.08，6.56）]，组间比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；短片段100 bp 在病例组和对照组血浆中表达水平分别为[33.99（16.36，58.44）]和[14.22（12.11，16.61）]，组间比较，差异有统计学意义（P＜0.05），见图1。

图1 两组长、短片段血浆cfDNA 含量比较

2.2 两组血浆cf-DNA 完整性比较 病例组血浆cf-DNA 完整性水平为[0.38（0.30，0.62）]，高于对照组的[0.24（0.08，0.36）]，但差异无统计学意义（P＞0.05），见图2。

图2 两组血浆cf-DNA 完整性比较

2.3 ROC 曲线分析 通过对血浆长片段241 bp 和短片段100 bp 含量及cf-DNA 完整性的ROC 曲线分析，241 bp hTERT 区间曲线下面积为0.79（95%置信区间为0.64～0.94，P＜0.0001），cut-off 值为5.96，敏感度为70.00%，特异度为90.00%；100 bp hTERT区间曲线下面积为0.99（95%置信区间为0.98～1，P＜0.0001），cut-off 值为16.13，敏感度为100.00%，特异度为95.00%；cf-DNA 完整性曲线下面积为0.59（95%置信区间为0.46～0.73，P=0.1985），cut-off 值为0.29,敏感性44.46%，特异度85.00%，见图3。

图3 ROC 曲线分析图

2.4 标准曲线的建立 构建成β-actin 及241 bp、100 bp 质粒标准品的扩增曲线，β-actin 标准曲线的线性决定系数（R2）=0.9583，扩增效率达93.40%；100 bp 标准曲线的线性决定系数R2=0.8745，扩增效率达91.70%；241 bp 标准曲线的线性决定系数R2=0.9695，扩增效率达99.30%。内参β-actin 及100 bp 及241 bp 目的基因熔解曲线出现微量杂峰，见图4。

图4 目的基因扩增曲线和熔解曲线图

图4 目的基因扩增曲线和熔解曲线图（续）

2.5 有、无淋巴结转移乳腺癌患者血浆cf-DNA 完整性比较 无淋巴结转移乳腺癌患者血浆cf-DNA 完整性为[0.18（0.13，0.22）]，有淋巴结转移的乳腺癌患者血浆cf-DNA 完整性为[0.33（0.22，0.63）],组间比较，差异有统计学意义（P＜0.05），见图5。

图5 有、无淋巴结转移血浆cf-DNA 完整性比较

3 讨论

癌症会随着时间的推移改变形状和形式，故乳腺癌早期诊断对于降低癌症相关死亡率至关重要[12，13]。血浆cf-DNA 被认为是诊断癌症的新型标志物，可以提供潜在临床相关信息的生物来源，满足在精准医学领域上方便微创的进步需要[14]。以上原因使得cf-DNA 分析成为肿瘤分子生物学领域的研究热点。当机体处于癌症状态时,外周血浆cf-DNA 增多[15，16]。因此，可通过无创性血浆cf-DNA 检测来早期诊断乳腺癌。

本研究选取Alu 序列241 bp 和100 bp hTERT目的基因作为扩增的长短片段，分析病例组与对照组中血浆cf-DNA 长短片段的含量，发现病例组血浆cf-DNA 含量高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05），与Miao Y等[17]研究结果一致，分析原因可能为自噬和坏死将更高浓度的基因组DNA 从肿瘤细胞释放到循环中，此外癌症患者血清中的DNA 酶活性受到抑制，而健康受试者则没有。有学者报道[18]，高水平的血浆cf-DNA 与侵袭性分子肿瘤谱和癌症的代谢活性有关。本研究对病例组和对照组血浆cf-DNA 完整性的进一步分析发现，病例组cf-DNA 完整性高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05），其结论与Kamel AM等[19]结果相似，考虑可能归因于肿瘤组织中的高坏死活性，吞噬细胞无法全部清除凋亡和坏死细胞，从而升高了血液中长DNA 片段的浓度，引起血浆cf-DNA 完整性显著升高。然后，使用ROC 曲线评估血浆循环游离DNA 在乳腺癌诊断上的作用，再分析血浆循环游离DNA 含量和完整性后发现，241 bp hTERT 区间曲线下面积为0.79，cut-off 值为5.96，敏感度为70.00%，特异度为90.00%；100 bp hTERT 区间曲线下面积为0.99，cut-off 值为16.13，敏感度为100.00%，特异度为95.00%；cf-DNA 完整性曲线下面积为0.59，cut-off值为0.29,敏感性44.46%，特异度85.00%，说明血浆cf-DNA 的长短片段和完整性的敏感度、特异度均较高，与Cao G等[20]结果类似，其研究也发现血浆cf-DNA 的敏感性和特异性以及完整性高于传统肿瘤生物标志物，提示血浆cf-DNA 可以起到健康筛查与辅助诊断的作用。

研究表明[21]，在淋巴和远处转移性患者中，乳腺癌血浆cf-DNA 完整性直接定量显示升高。本研究结果显示，无淋巴结转移乳腺癌患者血浆cf-DNA 完整性为[0.18（0.13，0.22）]，有淋巴结转移的乳腺癌患者血浆cf-DNA 完整性为[0.33（0.22，0.63）],组间比较，差异有统计学意义（P＜0.05），分析认为发生肿瘤转移后肿瘤负荷、血管分布、细胞生长更加旺盛[22]，提示cf-DNA 完整性可用作乳腺癌的动态监测。不同的机构未采用统一标准的操作前分析流程（样本收集，DNA 提取方法，试剂盒的应用），导致研究结果存在差异，因此对于血浆cf-DNA 片段大小、完整性与实体肿瘤、肿瘤标志物及肿瘤分期、类型等的关系还需要深入研究。

综上所述，血浆cf-DNA 作为液体活检的一种标志物，其含量和完整性可以作为乳腺癌辅助诊断的潜在生物学指标，在乳腺癌临床实践中可提高乳腺癌患者的诊断率。同时淋巴结转移与完整性相关，乳腺癌淋巴结完整性高于无转移者，但其机制仍尚未明确，且其诊断价值与肿瘤负荷的关系也存在争议。癌症中血浆cf-DNA 片段的大小分布可能是另一个信息参数，代表不同的释放机制和细胞外代谢过程。采用不同的血浆循环游离定量方法导致缺乏标准水平范围，并且与临床数据和终点相比，会出现差异结果。总而言之，cf-DNA 液态活检是未来可期的技术，虽然目前面临着一些研究和临床应用的难题，但随着医学相关技术的快速发展，相信cf-DNA在临床疾病诊断方面具有应用前景。