鲍鱼内脏多糖提取物免疫功能的初步研究*

陈思远，萧建斌，苏经迁

（1.福建师范大学生命科学学院 福建师范大学南方海洋研究院，福建 福州 350117；2.福建师范大学南方生物医学研究中心 福建省天然免疫生物学重点实验室，福建 福州 350013）

鲍鱼是一种具有重要经济意义的海洋软体动物，其渔业和加工产业在全球20个国家成为支柱产业[1]。鲍鱼的经济效益在福建省的水产养殖种类产值中排第一位[2]。目前，鲍鱼养殖产业的兴起推动了相关行业的蓬勃发展，并创造了巨大的生态效益和经济效益，但大量废弃的鲍鱼内脏带来新一轮的问题[3]。

鲍内脏多糖提取物（abalone viscera polysaccharides extract，AVPE）是通过蛋白酶酶解和超滤技术从鲍鱼内脏中分离提取出来的一类大分子活性物质[4]。研究表明AVPE富含的多糖、矿物质和脂质等多种营养物质具有抗氧化和增强免疫力等生物学作用[5]，在生物体内发挥多种生物功能和活性作用，如免疫调控、抑菌、抗氧化、抗肿瘤等[6-8]，但对其在生物体内是否能够激活特异免疫功能，是否产生慢性或急性毒性还未明确。因此，本研究以C57BL/6小鼠为试验对象，通过对AVPE的免疫功能活性和毒性进行探究和验证，为鲍鱼副产物的多方面利用提供佐证。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

鲍内脏多糖提取物（AVPE）由福建省水产研究所提供，其中多糖含量为58%；猪苓多糖购于上海源叶生物科技有限公司；刀豆蛋白（ConA）购买于美国适马（Sigma）公司；绵羊红细胞（SRBC）、HBSS、DMSO溶液购于北京索莱宝（Solarbio）公司；豚鼠血清（Guinea Pig Serum）购于北京博尔西（Bersee）公司；二硝基氟苯（DNFB）购于上海麦克林（Macklin）公司；复方环磷酰胺片（Compound Cyclohosphamide Tablets）购于通化茂祥制药有限公司。其余药品均为国产分析纯。

Countstar BioTech （IC1000），上海睿钰生物科技有限公司；INFIINITE 200 PRO酶标仪，瑞士帝肯（Tecan）公司；MCO-170AICDL-PC二氧化碳培养箱，日本松下（Panasonic）公司；AVANTIJ-26SXP高速冷冻离心机，美国贝克曼（Beckman）公司。

1.2 实验动物

C57BL/6 小鼠，雌雄比例对半，体重21～25g，均由福建师范大学实验动物中心饲养；自由摄水、采食。

1.3 实验动物分组、造模及给药

实验开始对每只小鼠称重，将小鼠雌雄各3只分成空白对照组（C），阳性药物组（PC），AVPE低剂量组（LD），AVPE中剂量组（MD），AVPE高剂量组（HD）。LD、MD和HD组分别用AVPE（20、40、80 mg/kg·d）进行灌胃，PC组为猪苓多糖（40 mg/kg·d），C组为同等剂量生理盐水。药品由生理盐水配制，每隔24 h灌胃给药1次，每只剂量为0.1 mL，自由摄水、采食。

2 实验方法

2.1 AVPE 对小鼠体重和脏体比的影响

观察实验期间动物的一般表现及形态，并在AVPE各组小鼠实验结束前记录体重及其增量。取各组小鼠，禁食15 h前灌胃给药1次，记录体质量后，颈椎脱臼处死；取其五脏为心、肝、脾、肺、肾，记录质量并计算脏器系数（脏体指数=器官质量/体质量×100%）。

2.2 ConA 诱导的小鼠脾淋巴细胞增殖

参考王璐等[9]的方案在最后一次给药12 h后，取各组小鼠脾脏于HBSS中，研碎，制成细胞悬液。取培养板放入细胞悬液，加入ConA液（10 μg/mL），放入37 ℃培养箱中72 h。每孔取0.8 mL培养液和1 mL DMSO到96孔培养板中，OD值由酶标仪（570 nm）测定。

式中：A——淋巴细胞增殖能力；OD1——ConA孔中OD值；OD2——对照孔的OD值。

2.3 DFNB 诱导小鼠迟发性超敏反应（DTH）

各组小鼠腹部位置进行毛发脱落，根据姚满林等[10]的方案，用50μL的1%DNFB试剂擦拭致敏2 d。在第五天用10μL的DNFB溶液擦拭于各组小鼠右耳（两面），经过1 d的刺激，颈椎脱臼处死小鼠，取下左右耳壳直径8 mm的耳片过磅。迟发性超敏反应（Delayed Type Hypersensitivity，DTH）以左右耳重量之差表示。

2.4 抗体生成细胞

参考赵庆枫等[11]的方案，每组小鼠灌胃55 d，腹腔注射0.2 mL SRBC，连续注射5 d。将脾脏细胞悬液0.1 mL放于0.3 mL豚鼠血清和0.3 mL 10% SRBC混悬液中混合。离心5 min，取上清于96孔板中，用酶标仪（540 nm）测定抗体生成细胞含量的OD值。

2.5 血清溶血素水平

各分组小鼠连续灌胃55 d，再连续腹腔注射5 d的0.2 mLSRBC。根据朱艳等[12]的方案，对眼球取血，离心收集血清。设置加0.2 mL10% RBC实验组在200μL稀释血清中和200μL生理盐水的对照组；温浴后，测定SRBC半数溶血的OD值（540 nm）。用HC50表示血清溶血素的水平，按下式计算：

2.6 急性毒性试验

根据景慕娴等[13]的方案，对小鼠禁食16 h，不禁水。对正常AVPE组与生理盐水对照组均灌胃给药，为0.1 mL 2000 mg/kg的AVPE。14 d内记录小鼠表现及死亡数。

2.7 骨髓微核率

参考王波[14]的方案，对各组小鼠连续两天灌胃给药。其中，PC组给予 40 mg/kg环磷酰胺，C组给予生理盐水，供试组为AVPE组。给药 6 h后，颈部脱臼处死小鼠，用小牛血清对股骨骨髓制片固定并染色。用显微镜记录每只小鼠1200个嗜多染红细胞（PCE），计算出微核率和PCE/RBC值。

2.8 精子畸变率

对照彭晓明等[15]的方法，每组取6只25～30 g性成熟雄性小鼠，环磷酰胺（40 mg/kg）为PC组，C组给予生理盐水，供试组为AVPE组。小鼠连续5 d灌胃，隔30 d后脱颈处死，取小鼠左右两侧附睾尾制片和染色，统计精子畸变发生率。

2.9 统计学分析

两组间比较用t检验，由Graphpad prism 9.0和Adobe Illustrator软件绘图。P＜0.05表示差异有统计学意义（*，P＜0.05；**，P＜0.01；***，P＜0.001；****，P＜0.0001）。

3 实验结果

3.1 AVPE 对小鼠脏器比重的影响

脏器系数增大或减小，可表明动物是否染毒。由图1可以看出，AVPE各剂量组小鼠的心、肝、脾、肺、肾的脏比重均与C组相似，不具有差异显著性（P＜0.05）。初步表明鲍多糖对小鼠的心、肝、脾、肺、肾脏器体重比值无影响。

图1 AVPE对小鼠脏器比重的影响

3.2 AVPE 对小鼠体重的影响

由图2可知，不同剂量的AVPE与C组相比，小鼠体重在28d持续灌胃中保持稳定，对小鼠体重的变化无显著变化。试验结果表明AVPE对小鼠体重变化无影响。

图2 AVPE对小鼠体重的影响

3.3 AVPE 对脾淋巴细胞增殖能力的影响

淋巴细胞在免疫系统中扮演着免疫识别的角色，可通过刀豆蛋白（conA）和植物血球凝集素来诱导[16]。结果如图3所示，C组的淋巴细胞增殖能力OD值为0.094，三组不同剂量AVPE（20、40、80 mg/kg/d）的OD值分别为0.081、0.080、0.087，与C组相比无差异显著性（P＞0.05）。实验结果表明口服AVPE对小鼠脾淋巴细胞增殖能力无显著影响。

图3 AVPE对小鼠脾脏淋巴细胞增殖能力的影响

3.4 鲍多糖对DNFB诱导小鼠DTH的影响

小鼠耳肿胀模型是非特异性炎症模型，可以通过肿胀程度判断受试反应[17]。通过对比图4的结果发现，与C组相比，LD、MD、HD组的耳肿胀程度无显著差异性（P＞0.05）；实验结果表明AVPE对小鼠细胞免疫功能无显著影响。

图4 AVPE对DNFB诱导小鼠DTH的影响

3.5 AVPE 对小鼠抗体生成细胞数的影响

特异性抗体细胞生成的数量反应了体液免疫的水平[18]。结果如图5所示，PC组的抗体生成细胞数比C组小鼠略有上升，但无显著差异性（P＞0.05）。不同剂量的AVPE组对抗体生成细胞数无显著影响（P＞0.05）。实验结果表明AVPE对小鼠抗体生成细胞的增殖无显著影响。

图5 AVPE对小鼠抗体生成细胞数的影响

3.6 AVPE 对小鼠血清溶血素的影响

SRBC 与相应抗体结合，可导致红细胞溶解，从而统计血红蛋白的数量得知抗体产生的水平[19]。结果如图6所示，LD、MD、HD组溶血素表达量分别为647、647、697，与C组（624）相比无显著性变化（P＞0.05），表明AVPE对小鼠血清溶血素的表达无显著影响。

图6 AVPE对小鼠血清溶血素的影响

3.7 AVPE 的急性毒性试验

为评价AVPE的安全，试验通过对各组小鼠单次灌胃2000 mg/kg的AVPE，观察试验小鼠出现的中毒数量、体重变化及死亡情况，评价受试药物毒性作用的性质[20]。结果如表1所示，在试验期间，各组小鼠饮食和活动均正常，未有死亡状况。

表1 鲍多糖的急性毒性试验结果

3.8 AVPE 对小鼠骨髓微核率和PcE／RBc的比值的影响

微核是细胞受到外界刺激导致染色体断裂或纺锤丝受损，而形成异常结构[21]。结果如图7所示，LD、MD、HD组的微核率分别为0.162%、0.140%、0.114%，PC组的微核率为0.763%，C组的微核率为0.126%。PC组与C组比较有显著增加（P＜0.0001），AVPE组与C组相比无显著性差异（P＞0.05）。实验结果表明AVPE对小鼠骨髓微核率无显著影响。

图7 AVPE对小鼠骨髓微核率的影响

骨髓细胞PcE/RBc的比值可以判断药物对骨髓细胞的毒性作用[22]。结果如图8所示，LD、MD和HD组的PcE/RBc比值分别为13.086%、12.424%和12.764%，PC组的平均PcE/RBc比值为10.998%，C组的微核率为12.658%。PC组与C组比较有显著减少（P＜0.001），AVPE组与C组相比无显著变化（P＞0.05）。实验结果表明AVPE对小鼠骨髓细胞PcE/RBc比值无显著影响。

图8 AVPE对小鼠骨髓细胞PCE/RBC的影响

3.9 鲍多糖对小鼠精子畸变率的影响

精子畸形是精子基因发生突变的结果[23]。如图9所示，与C相比，LD、MD、HD组的精子畸变率无显著差异（P＞0.05），PC组的精子畸形率有显著提高（P＜0.0001）。实验结果表明AVPE对雄性小鼠精子畸形率无显著影响。

图9 AVPE对小鼠精子畸变率的影响

4 讨论

本文通过对各组小鼠给予适当剂量AVPE，探究了AVPE对小鼠免疫功能的调节作用。结果表明AVPE对小鼠细胞免疫和体液免疫无显著效果，同时对小鼠的质量、脏器指数无显著影响。在毒性经口方面，给予高剂量AVPE灌胃小鼠，未表现异常症状，初步说明在剂量低于2000 mg/kg的AVPE具有较高的食用安全性，不会对受试动物产生突变作用和生殖毒性。

综上所述，AVPE未表现出明显的免疫调节作用，研究采用各浓度的AVPE不产生慢性或急性毒性。AVPE作为鲍鱼副产物如能有效利用研发出新型产品，不仅可以开拓鲍鱼内脏市场，还可以解决环境污染问题。本研究为鲍鱼副产物的加工利用提供科学依据和多种出路。