中性粒细胞、单核/巨噬细胞、淋巴细胞在肾纤维化发生发展中的作用研究进展

陈凤，桂明，赵丽娟

中南大学湘雅三医院风湿免疫科，长沙 410013

肾纤维化的发生与慢性肾脏病（CKD）进展及预后密切相关，成年CKD 的发病率为10%～13%。肾纤维化是导致肾功能逐渐丧失的主要因素［1］，肾纤维化过程主要有以下几个步骤：①肾脏损伤引发的炎症激活和免疫细胞浸润；②生长因子、趋化因子和细胞因子等促纤维化介质的释放；③细胞外基质（ECM）合成/降解不平衡，导致肌成纤维细胞（MF）激活和ECM 在肾小管间质的过度积聚；④肾脏实质细胞出现不可逆转损伤，肾小管萎缩；⑤肾脏微血管减少、毛细血管稀疏［2-3］。肾早期纤维化病变并非均匀分布于整个肾实质，而是从某些局部部位开始，形成微小的“纤维化生态位”，并伴随对中性粒细胞、单核/巨噬细胞、淋巴细胞浸润等［4-8］。本文对上述细胞在肾纤维化发生发展中的作用机制进行总结，为肾纤维化的发病机制及抗纤维化药物的研发提供新思路。

1 中性粒细胞在肾纤维化发生发展中的作用机制

中性粒细胞在人类循环白细胞中占比为50%～70%，主要源于造血干细胞，在骨髓中发育成熟，由粒—单核祖细胞经历原始粒细胞和其他成熟阶段粒细胞，最终发育成成熟的中性粒细胞。粒细胞集落刺激因子（G-CSF）主要负责中性粒细胞从骨髓中的发育、产生和释放调控，G-CSF 通过下调趋化因子受体4（CXCR4）降低成熟中性粒细胞在骨髓中的残留，并通过上调趋化因子受体2（CXCR2）促进成熟中性粒细胞自骨髓中释放，维持中性粒细胞的保留/释放平衡［9］。中性粒细胞在组织损伤以及免疫反应过程中，经过趋化作用会迅速迁移至炎症发生部位，通过释放活性氧（ROS）自由基、生成细胞因子和形成中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）等机制而发挥作用［10-11］。

中性粒细胞是晚期肾纤维化中最常见的免疫细胞群之一［10-12］。既往研究表明，当肾脏细胞受损时，会释放损伤相关分子模式（damp），导致先天性免疫细胞浸润，中性粒细胞释放 ROS 和颗粒内容物，从而直接损伤肾细胞，并产生大量促炎介质来吸引和激活其他免疫细胞，间接损伤肾细胞［9］。 RYU 等［12］在慢性单侧输尿管梗阻（UUO）小鼠模型中发现，其受损的肾脏中含有大量的Siglec-F+中性粒细胞，主要来源于肾血管中的常规中性粒细胞，可以由转化生长因子β1（TGF-β1）和粒细胞集落刺激因子（GCSF）诱导表达，而Siglec-F+中性粒细胞能通过产生TGF-β1、肿瘤坏死因子α（TNF-α）和白细胞介素1β（IL-1β）激活成纤维细胞，同时直接分泌胶原蛋白1（COL1A1）来促进肾纤维化；而后该研究进一步在局灶节段性肾小球硬化（FSGS）模型和肾缺血/再灌注损伤（IRI）模型上进行实验，结果均发现有Siglec-F+中性粒细胞表达；进一步在数据库中搜索，发现CKD 患者Siglec-8+（Siglec-F 的旁系同源物）中性粒细胞增加也可能与肾脏疾病恶化有关。此外，Siglec-F+中性粒细胞被证实参与了肾纤维化的发生， 但其激活成纤维细胞和直接分泌胶原蛋白1（COL1A1）两种促纤维化机制究竟哪一种占据主导地位，目前暂无定论。且目前仅研究了亚群Siglec-F+中性粒细胞与肾纤维化的关系，其他亚群与肾纤维化的关系尚未可知。

此外，中性粒细胞参与纤维化的机制报道较多的是NETs［13］。NETs 是由活化的中性粒细胞分泌，是一种由DNA、组蛋白和抗菌蛋白组成的网状结构，NETs的形成往往会伴随中性粒细胞的溶解性死亡，这种死亡过程被称为“NETosis”。NETosis 主要有两种模式，一种经典途径是指中性粒细胞的炎症性死亡，也称为自杀式NETosis，特点是NETs释放伴随中性粒细胞死亡，表现为细胞膜破裂、核脱落、核膜解体等，是目前研究的主要途径；另一种非经典途径则是NETosis的非溶性形式，也叫做活体式NETosis，特点是中性粒细胞在释放NETs后仍存活，染色质以囊泡出芽的方式排出，细胞核膜、质膜完整，留下活跃的无核中性粒细胞，继续行使吞噬功能。目前非经典途径的具体机制以及生理意义尚未明确［10，14］。

虽然关于中性粒细胞参与CKD 的具体机制尚不明确，但目前已有研究报道NETosis 与肾脏上的胶原蛋白生成有关。有研究采用高糖诱导的NETs来干预人肾小管上皮细胞，结果显示肾小管区域E-钙黏蛋白（E-cadherin）表达下调、α-SMA 表达上调，并提示NETs可能通过介导肾小管间充质转化进程参与了糖尿病肾纤维化；而在长期给予低剂量双酚A（BPA）的小鼠模型中，小鼠出现慢性肾功能下降，也出现了NETs 标志蛋白在肾小球的沉积，当NETs 被脱氧核糖核酸酶Ⅰ （DNaseⅠ ）降解，双酚A（BPA）诱导的足细胞损伤也得到缓解，提示NETs有可能在BPA 诱导的慢性肾损伤过程中具有重要作用［15］。而在自身免疫性肾病的发生过程中， NETosis参与肾纤维化的机制更为复杂，常常涉及到自身免疫性疾病中的抗体以及肾脏上的免疫复合物，当自身抗体效应机制未能及时消除NETs相关抗原时，就会发生炎症组织损伤和细胞内抗原释放，免疫介导损伤后组织修复机制的激活又可导致纤维化的发生，并最终导致肾衰竭［9］。目前，NETs 与肾纤维化的研究仍处于起步阶段。近来有文献报道，在伤口修复的瘢痕组织内NETs 浸润增加，可能与Toll样受体9（TLR9）/NF-κB/IL-6通路激活成纤维细胞，并通过IL-6促进胶原蛋白分泌有关［16］。但目前该通路与肾纤维化的关系暂无报道，未来或许可从这方面进行研究。

2 单核/巨噬细胞在肾纤维化发生发展中的作用机制

单核/巨噬细胞作为一种免疫细胞，随着急性肾损伤向CKD 的进展也会发生表型转换。单核/巨噬细胞是由单核细胞、巨噬细胞和树突状细胞组成的单核吞噬细胞系统，分为肾脏常驻单核吞噬细胞和循环系统来源的单核吞噬细胞。目前单核/巨噬细胞主要分为M1型和M2型单核/巨噬细胞两类。M1型单核/巨噬细胞是促炎细胞，在急性肾损伤早期发挥作用，其表型特征多为CD38、CD80 等，当肾损伤未解决且进行性加重时，开始出现M1 型向M2 型的转化；M1 型单核/巨噬细胞表达的诱导型一氧化氮合酶（NOS2 ）和基质金属蛋白酶12（MMP-12）减少，而随着肾小球和间质纤维化的不断进展，M2 型单核/巨噬细胞表面的CD163和CD206表达增加［17］。

当肾脏损伤未能得到控制或存在持续性炎症反应时， M2 型单核/巨噬细胞会被持续性激活，发挥抗炎、促进组织修复、血管再生、纤维化发生等功能。M2 型单核/巨噬细胞有三个亚群，即为M2a、M2b、M2c。M2a 型单核/巨噬细胞是由IL-4 和 IL-13诱导产生的，参与诱导抗炎TH2 样免疫反应，具有促进伤口愈合和组织纤维化的作用。免疫复合物诱导M2b 型单核/巨噬细胞参与免疫调节，并有助于TH2 的激活，IL-10、TGF-β 和糖皮质激素均可诱导M2c 型单核/巨噬细胞的分化。M2c型单核/巨噬细胞有助于免疫抑制、基质重塑和组织修复［17］。在CKD 的发生过程中，与纤维化密切相关的主要是表达 CD206 和（或）CD163 的M2 型单核/巨噬细胞。肾小球 CD163+M2 型单核/巨噬细胞的数量与肾小球硬化、间质纤维化和肾小管萎缩相关，间质中的CD163+M2 型单核/巨噬细胞存在于活动性纤维化区域，并产生结缔组织生长因子［18］。而CD206+M2型单核/巨噬细胞的数量与亚临床炎症、肾小管损伤和纤维化进展相关［19］，并且M2 型单核/巨噬细胞产生的CC 家族趋化因子配体18（CCL18） 与进行性超滤失败和腹膜纤维化相关［20］。

在肾纤维化的过程中，单核/巨噬细胞主要通过分泌细胞因子，促进成纤维细胞活化以及ECM 产生，或者通过单核/巨噬细胞间充质转化而直接参与ECM的合成，涉及通路主要有Notch信号通路、TGF-β/Smad 信号通路、Wnt/β-连环蛋白信号通路等［19-22］。近来有学者提出，TGF-β1/Smad3 信号通路可以以酪氨酸蛋白激酶类（Src）为中心调节中枢，促进单核/巨噬细胞直接转变为受损肾脏内的肌成纤维细胞（MMT），产生胶原蛋白并促进ECM 沉积，因此提出MMT 可能是慢性炎症疾病进展为致病性纤维化的关键［17］。但单核/巨噬细胞间充质转化的过程仍然存在争议，原因之一是肾纤维化模型的骨髓谱系尚未确定单核/巨噬细胞间充质转化，另外一个原因则是单核/巨噬细胞间充质转化过程只能在伴有进行性肾纤维化的活动性炎症病变中观察到，而在急性炎症或非进行性肾纤维化病变中却很少见。因此，单核/巨噬细胞间充质转化是否在急性肾损伤到CKD 的过程中发挥关键作用仍不确定［23］。

除此之外，Wnt 作为通路之一有19 种亚型，单核/巨噬细胞聚集于再生的肾脏组织中可表达Wnt4、Wnt7b、Wnt10a 和Wnt10b，而绝大部分Wnt 主要是通过与TGF-β信号通路之间相互作用而促进纤维化进展。Wnt5a 可以增强 TGF-β 诱导的M2 型单核/巨噬细胞极化和Yes 相关蛋白（Yap）/具有PDZ结合基序的转录共激活因子（Taz）表达，从而促进肾纤维化。当TGF-β1作用于骨髓衍生单核/巨噬细胞（BMDM），可发生单核/巨噬细胞转化为MF，Wnt3a/β-连环蛋白信号通路相关蛋白表达升高，而当敲除骨髓细胞中的Wnt3a，则可导致单核/巨噬细胞积累和M2 型单核/巨噬细胞极化减少，从而减轻UUO 小鼠模型的肾纤维化［22，24-25］。但KIEWISZ 等［26］认为，Wnt4 与肾纤维化无关。因此，上述指标与肾脏单核/巨噬细胞的关系仍有待研究。目前的研究并未阐明TGF-β 信号通路下游信号分子如Smad 家族是否参与了该过程，另外Wnt 信号与TGF-β 信号通路参与了MMT 的交流机制、以及Wnt信号通路调控肾纤维化过程中单核/巨噬细胞间充质转化与上皮细胞相互作用的关联性也值得继续研究［25］。在肾纤维化的生态位早期，其细胞外基质蛋白召集可溶因子如Wnt和TGF-β，从而创造出独特的纤维化微环境。因此，Wnt、TGF-β 与早期炎症细胞浸润的关系更值得进一步研究。此外，Notch 信号通路可通过炎症、TGF、间充质转化等机制在肾间质纤维化、糖尿病肾病等肾脏疾病中发挥重要作用。Notch 信号通路与肾小管上皮细胞以及足细胞相关，共有3个亚型，对于这3个亚型是否与免疫细胞浸润有关仍需进一步探讨。

3 淋巴细胞在肾纤维化发生发展中的作用机制

T 淋巴细胞是细胞免疫中的主要效应细胞，在肾脏疾病尤其是免疫介导性肾病的发生发展中具有重要作用［27］。参与肾炎发生发展的主要是CD4+及CD8+T 淋巴细胞，而与肾纤维化相关的是CD4+T 淋巴细胞。淋巴细胞可被肾损伤信号激活分化为不同的Th 细胞，产生特定的细胞因子。T 淋巴细胞参与肾脏损伤的作用机制有：①淋巴细胞在肾组织内聚集和活化，并通过细胞毒作用直接杀伤细胞；②通过趋化或激活单核/巨噬细胞和自然杀伤细胞，诱导迟发型变态反应，造成肾脏损伤；③通过释放肿瘤坏死因子等细胞因子，参与及扩大炎症反应。

CD4+T淋巴细胞的分化类群与免疫微环境的刺激密切相关，能分化成不同的细胞亚群并发挥不同作用。Th1、Treg 细胞发挥抗纤维化作用，Th2、Th17、Tfh细胞促进纤维化作用，NK细胞则具有双重作用。Th2细胞在UUO小鼠模型中具有促肾纤维化作用，但在急性肾损伤中又发挥保护作用，故在急性肾损伤向CKD 转换时，如何维持Th2 细胞平衡对于减轻肾纤维化可能具有一定的意义。Th17 细胞主要分泌IL-17，IL-17 不仅参与诱导中性粒细胞的动员和激活、还参与巨噬细胞介导的组织损伤，导致组织炎症损伤加重。在肾梗阻模型中，IL-17A 通过促进趋化因子RANTES表达，介导肾脏组织中白细胞、巨噬细胞浸润，从而促进肾纤维化，当使用IL-17A拮抗剂阻断后纤维化程度减轻。但也有学者认为，IL-17A 拮抗剂对严重缺血再灌注损伤后的肾纤维化无效，这可能与缺血再灌注损伤的程度有关。因此，IL-17A 细胞因子家族抑制剂是否可以应用于肾纤维化的治疗还有待探索，而IL-17家族中的其他细胞因子亚型和CKD 的具体发病过程也需要进一步研究。

Treg 细胞占 CD4+T 淋巴细胞总数的 5%～10%，具有抗炎、抗纤维化作用，Treg 细胞缺失会促进炎症反应和急性肾小管坏死，加剧肾功能下降。研究表明，在肾脏缺血再灌注损伤的早期阶段，Treg细胞通过产生IL-10发挥抗炎效应，而在缺血性和肾毒性急性肾损伤过程中，Treg 细胞的早期浸润可以延缓晚期纤维化进展，其抗纤维化作用已经通过CCL20 阻断剂、间充质干细胞—细胞外囊泡等的验证［28］。Th22 细胞则与慢性肾炎的严重程度呈正相关关系。在尿毒症患者中，Th22 细胞与微炎症状态相关，但其与肾纤维化的关系以及作用机制暂不明确［29］。其他淋巴细胞，如Th9 细胞、先天淋巴细胞、双阴性T 淋巴细胞、CD8+T 淋巴细胞、黏膜相关性T淋巴细胞、B 淋巴细胞等均可参与了肾纤维化的发生过程。

综上所述，中性粒细胞参与肾纤维化的机制报道较多的是NETs，多伴随中性粒细胞的溶解性死亡；单核/巨噬细胞主要是M2 型单核/巨噬细胞参与肾纤维化的发生，其通过复杂的信号通路，激活成纤维细胞及间充质转化来参与ECM 合成，从而促进肾纤维化的发展；T 淋巴细胞作为细胞免疫中的主要效应细胞，在纤维化的发展过程中兼具双重作用，这其实与T 淋巴细胞的不同亚型有关。总体来说，在肾纤维化损伤的不同阶段参与的细胞及其发挥的作用目前仍不清楚，未来仍需进一步探索。